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摘要:
本文详细研究了交联剂1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）对石墨烯量子点（GQDs）光学性质的影响及原因。采用水热法制备了GQDs，并与EDC反应得到GQDs/EDC复合物，对GQDs和GQDs/EDC的光谱特性进行研究。使用PBS溶液以及人工胃液样品，研究pH对GQDs/EDC荧光影响规律及作用机理。实验结果表明：GQDs表面缺陷被EDC钝化，使得GQDs的荧光在小于1 min内迅速增强，并在5~20 min内保持稳定；相比单独GQDs，GQDs/EDC的荧光强度显著提升约264倍；pH响应实验表明，在pH值为1.75~4.01及4.01~9.28范围内，GQDs/EDC具有荧光和吸收强度线性响应规律。生物兼容性表明，在25~300 µg/mL样品浓度下，人乳腺癌细胞存活率均大于80%；同时，对人工胃液pH具有较高的检测准确性，其相对标准偏差RSD ≤ 1.10%。EDC介导的荧光增强，使GQDs在检测、传感、成像等领域更具优势。同时，GQDs/EDC灵敏的pH响应特性使其在pH值检测应用中具有良好前景。
Abstract:In this paper, the effect of the cross-linking agent 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) on the optical properties of graphene quantum dots (GQDs) and the reasons are investigated in detail. GQDs were prepared by a hydrothermal method and reacted with EDC to obtain GQDs/EDC composites. The spectral properties of GQDs and GQDs/EDC were investigated. The effect of pH on the fluorescence of GQDs/EDC and its mechanism were investigated using PBS solution and artificial gastric juice samples. The experimental results show that EDC passives the surface defects of GQDs, making the fluorescence of GQDs increase rapidly in <1 min time and remain stable up to 20 min. Under different EDC contents the fluorescence intensity of GQDs/EDC is significantly enhanced by about 264 times compared to GQDs alone. The pH response experiments shows that GQDs/EDC had a linear response pattern of fluorescence and absorption intensity in the pH range of 1.75−4.01 and 4.01−9.28. Biocompatibility showed that the cell viability of human breast cancer cells was greater than 80% at sample concentrations of 25−300 µg/mL and remained at 74% even at high concentrations of 500 µg/mL; Finally, the detection of artificial gastric pH has high accuracy with relative standard deviation RSD ≤1.10%. The EDC-mediated fluorescence enhancement makes GQDs more advantageous in the fields of detection, sensing and imaging. Besides, the sensitive pH response characteristics of GQDs/EDC provide a good prospect for pH detection applications.
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Key words:
- graphene quantum dots /
- EDC /
- fluorescence enhancement /
- surface passivation /
- pH response
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1. 引 言
石墨烯量子点（GQDs）作为碳基纳米材料，相比于传统半导体量子点，其生物毒性更低，且具有丰富的亲水表面官能团、高电子迁移率和导电性、较强光吸收和可调的荧光性质等优点[1]。因此，在传感、成像、生物检测、光电器件等领域受到越来越多的关注[2-3]。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）作为一种交联剂，EDC能够首先与羧基反应形成O-酰基异脲中间体，随后与氨基反应形成酰胺键，从而起到羧基和氨基基团间的偶联作用，其可以应用在纳米材料、蛋白、多肽等具有羧基和氨基的物质中。相应的，EDC在量子点（QDs）纳米材料复合、表面功能性修饰、生物分子偶联等研究中也被高频使用[4-5]。
同样，在许多GQDs的相关报道中，EDC都是GQDs交联化学合成中的必要物质[6-7]。不同的是，多数传统量子点是激子发光过程，而GQDs有多种激发态电子辐射复合途径，包括表面态发光、扶手椅或锯齿形的边缘结构、共轭π域中量子限域效应的本征发光，及量子尺寸效应等，这些因素均影响且共同贡献于GQDs的发光特性[8]。以上原因使GQDs的光学性质对缺陷、官能团和外部环境改变更为敏感。因此，对于碳基纳米材料，交联剂用于官能团偶联过程时，其在材料周围的附着和表面基团改性等因素，也可能造成光学性质的改变。然而，针对此方面的研究很少被提及。
已知的相关报道中，2017年，Pan等人发现EDC能增强碳量子点（CDs）的荧光，他们基于这一现象设计了一种基于表面钝化的谷胱甘肽检测荧光传感器[9]。2015年，Liang等人也指出GQDs荧光能被EDC/NHS显著增强，并开展了荧光增强型GQDs用于高灵敏乙酰胆碱酯酶活性测定的研究[10]。虽然以上报道表明了EDC会对碳纳米材料的荧光有明显影响，但是更多的研究中似乎忽略了这一现象。这在许多利用材料光信号的传感和检测应用研究中，可能对结果分析造成误导。
在本工作中，将EDC与GQDs反应得到GQDs/EDC复合物。首先，研究了EDC对GQDs荧光性质的影响。通过将吸收、荧光和激发光谱数据做对比分析，证实EDC对GQDs的荧光具有显著增强效果。在EDC作用下，GQDs荧光峰强度展现出约264倍的增强效果。结合瞬态光谱中GQDs的荧光衰减动力学变化，对荧光增强的可能机制进行分析。随后，在实验中也发现了GQDs/EDC具有灵敏的酸性pH值响应特性。通过研究不同EDC含量及溶液pH值下的瞬态光谱，分析了GQDs/EDC的pH响应特性原因。最后，使用人工胃液作为待测样品检验该方法性能，结果表明该方法在胃液pH值检测中具有较高灵敏性和准确性，GQDs/EDC在实际样品中具有良好的应用前景。
2. 实验部分
2.1 实验试剂
一水柠檬酸（CA， 99.5%, Aladdin）、N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC， 98%， Sigma-Aldrich）、氢氧化钠（NaOH, 98%， Alfa Aesar）、PBS磷酸缓冲液（1X，Meilunbio）、盐酸（HCl，分析纯，北京化工）。人工胃液（Phygene Scientific）。
2.2 石墨烯量子点（GQDs）合成
GQDs的合成参考了文献[11]中的水热合成法。首先准备2.1 g一水柠檬酸（0.01 mol）放于烧杯中，加入50 mL去离子水搅拌溶解。称量1.2 g NaOH（0.03 mol）加入柠檬酸水溶液中，继续搅拌至完全溶解。将溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中。密封后放于鼓风干燥箱中，设置温度至160 °C，反应时间4 h。得到的产物使用透析膜（截留分子量：500）纯化24 h，以去除多余盐和离子，最后置于密封避光环境中保存备用。
2.3 GQDs/EDC复合及光谱表征
配制浓度为15.28 mg/mL的EDC水溶液，使用150 µL浓度为0.01 M的PBS溶液与50 µL的EDC溶液在27 °C下混匀5 min。随后加入250 µL的GQDs原溶液，继续混匀10 min。测量前将反应后溶液使用PBS定容至2 mL。为表征GQDs和GQDs/EDC的吸收和荧光性质，使用Cary-5000分光光度计测量UV-vis吸收光谱，以及Cary Eclipse荧光光谱仪（Agilent Technologies）测量光致发光光谱（PL）。为确定GQDs表面基团，使用Nicolet iS50傅里叶红外（FTIR）光谱仪（Thermo Fisher Scientific）。瞬态光谱使用配有375 nm皮秒光源的FLS980光谱仪（Edinburgh Instrument）测量。
2.4 GQDs/EDC的pH响应特性测试
使用PBS（pH值 7.2， 0.01 M）作为反应溶剂，并用HCl及NaOH水溶液调节PBS的pH值，同时使用玻璃电极pH计进行测量。GQDs/EDC的pH响应实验中，按照2.3节方法，并替换溶剂为调节pH值后的PBS。测量pH值在 1.75−11.29区间内各样品的荧光和吸收光谱，各组数据重复测量3次。在实际样品pH值检测中，同样使用HCl及NaOH调节人工胃液样品的pH，将PBS替换为人工胃液样品。使用5组或5组以上不同pH值（0−3）的胃液样品绘制标准曲线并拟合线性关系，随后将待测样品的PL积分强度带入线性公式，并将结果与pH计测量结果做比较。
3. 结果与讨论
3.1 石墨烯量子点的表征
图1(a)为GQDs的透射电子显微镜（TEM）图像，其颗粒分散均匀，近似圆形。图1(b)中粒径分布柱状图表明GQDs直径主要分布在2~4.5 nm之间，与目前报道相符[12]。通过XRD对合成的GQDs进行结构分析。图1(c)（彩图见期刊电子版）结果显示，与石墨PDF标准比对卡相比，GQDs在2θ=25°附近出现衍射峰，为石墨的（002）晶面衍射峰，较弱的峰强和展宽是由于石墨烯少层结构，以及粒径的减小使晶体无序度增加、结构完整性下降导致的[13]。当溶液中引入EDC试剂后，GQDs/EDC的形貌图像如图1(d)所示，纳米颗粒间分布间隙减小，呈现出局部聚集状态。后续的荧光光谱测量结果表明这种聚集不会对GQDs发光性质造成负面影响，相反，GQDs/EDC的荧光得到了显著增强。
图 1 （a）GQDs的TEM图像；（b）尺寸分布柱状图及（c）与JCPDS 75-1621标准对比的GQDs XRD图谱；（d）GQDs/EDC复合材料TEM图像Figure 1. (a) TEM image of GQDs; (b) histogram of size distribution; (c) XRD pattern of GQDs compared with JCPDS 75-1621 standard; (d) TEM image of GQDs/EDC composites为了解GQDs上可能存在的表面基团，对反应物柠檬酸（CA）和产物GQDs的FTIR吸收光谱进行了测量。如图2（彩图见期刊电子版）所示，CA中（蓝线）3036 cm−1和780 cm−1分别对应C-H键伸缩振动（νC-H）和CH2的不对称摇摆振动（δas）。3362 cm−1和1110 cm−1归因于羟基或水分子中O-H键伸缩振动（νOH），1721 cm−1为C=O伸缩振动（νC=O），是CA分子中羧基和羟基等基团的特征吸收模式[14]。水热反应产物GQDs的FTIR光谱（红线）明显异于CA，其中出现两个明显的吸收峰1416 cm−1和1585 cm−1，可分别归因于GQDs表面去质子化羧酸根的对称（νaCOO−）和非对称伸缩振动（νasCOO−）模式，表明其表面存在含氧官能团如羧基[15]。同时，位于约3362 cm−1以及1260 cm−1的特征吸收峰是O-H键的伸缩振动模式，表明GQDs表面也可能存在羟基基团[16]。此外，在2920 cm−1 （νasC-H）和2852 cm−1 （νaC-H）存在的较弱的吸收峰，说明可能存在部分未完全碳化的CA，以及在1079 cm−1处的环氧基（νC-O-C）也表明GQDs面内部分氧化[17-18]。以上结果与相关报道做对比可证明成功合成了GQDs[19-20]。
3.2 GQD和GQDs/EDC的荧光性质分析
使用PBS（0.01 M）作为溶剂，分别测量了GQDs、EDC、PBS和GQDs/EDC溶液的光致发光光谱（PL），结果如图3（彩图见期刊电子版）所示。图3(a)中，360 nm激发条件下，单独GQDs的荧光信号微弱，而GQDs/EDC混合溶液荧光显著增强，其最高峰位波长为465 nm。局部放大如图3(b)所示，发现GQDs在460 nm处有较弱的荧光峰。EDC和PBS未发现明显荧光信号。因此排除了EDC和PBS自身荧光造成荧光增强的可能。此外，在约387 nm出现明显的尖峰，是由于溶液中水分子对激发光的散射所导致的，属于水的拉曼散射峰[21-22]。该峰的峰位会随激发波长的改变而移动，并且在下述GQDs的PL和PLE光谱中也存在。
图 3 （a）EDC，PBS，GQDs和GQDs/EDC的PL光谱及（b）PL光谱的局部放大图Figure 3. (a) PL spectra of EDC, PBS, GQDs and GQDs/EDC and (b) its local magnification为进一步了解GQDs及GQDs/EDC的荧光性质，分析了变激发下的PL和变探测波长下的光致激发光谱（PLE），见图4（彩图见期刊电子版）。图4(a)中，当激发波长分别为320、340和360 nm时，GQDs荧光逐渐增强，同时峰位从445 nm红移至460 nm。随后继续增加激发波长，荧光减弱。这种激发波长相关的PL特性，以及发光峰的非对称分布可能是由于GQDs的光激发态电子的不同辐射跃迁途径导致的。碳的SP2杂化域尺寸分布，面内与表面基团构成的表面态能级和缺陷能级共同影响并贡献于GQDs的发光特性[23]。GQDs的不同波长下的激发光谱如图4(b)所示，忽略溶剂水的拉曼峰，在440~530 nm的探测波长范围内，最大激发峰波长为355 nm，并且为非对称分布，表明探测波长处GQDs的发光来源于不同的能级跃迁。据报道，这是由于GQDs中的激发态电子最终会弛豫至表面态能级[24]。相应的，加入EDC后，GQDs的荧光和激发光谱分别如图4(c)、4(d)所示，其荧光和激发峰强度均显著提升。同时，由于EDC与官能团反应导致GQDs中电子和空穴位置发生改变，使GQDs/EDC的PL和PLE光谱最高峰波长相对于GQDs约有5 nm的红移[25]。此外，PL激发波长相关性消失，各激发波长下的荧光峰位均为465 nm。以上结果表明EDC改变了GQDs的发光过程，而荧光增强可能是由于EDC钝化了部分表面缺陷。
图 4 不同激发波长下（a）GQDs和（c）GQDs/EDC的荧光光谱，以及不同探测波长下（b）GQDs及（d）GQDs/EDC的激发光谱Figure 4. Fluorescence spectra of (a) GQDs and (c) GQDs/EDC at different excitation wavelengths, and excitation spectra of (b) GQDs and (d) GQDs/EDC at different detection wavelengths为了探究EDC对GQDs电子跃迁过程的影响，从稳态和瞬态PL光谱两方面进行了分析。首先，实验对比了GQDs和GQDs/EDC各自的吸收和激发光谱，如图5（彩图见期刊电子版）所示。图5(a)中结果显示，GQDs和GQDs/EDC的吸收峰分别为340 nm和360 nm，EDC在该波段无明显吸收。值得注意的是，GQDs/EDC的吸收光谱（绿）及其激发光谱（蓝）增强，且最高峰位均为360 nm，说明激发态电子弛豫过程与激发波长无关[26]，没有受到弛豫过程中缺陷能级的影响，表明缺陷能级显著减少，甚至消失。在图5(b)中，单独GQDs的激发峰为355 nm，与其吸收峰相比有15 nm的位移。这是因为GQDs中存在缺陷能级，导致在不同能量激发下的电子弛豫至最低激发态的途径不同。由于高能量的激发态电子具有更高的缺陷捕获概率，在最强吸收峰位340 nm的高能量光激发下，激发态电子更容易被缺陷捕获，从而导致弛豫过程中能量损失更大。而在激发峰位355 nm的较低能量光激发下，能量损失较小，激子辐射复合效率更高，因此激发光谱相对于吸收光谱发生红移。
图 5 （a）EDC，GQDs，GQDs/EDC的吸收光谱，以及460 nm探测波长下GQDs/EDC的激发光谱。（b）GQDs的吸收光谱及其460 nm探测波长下的激发光谱。（c）GQDs和（d）GQDs/EDC在不同探测波长下的瞬态PL衰减曲线。各样品最终体积定容至2 mL，EDC含量为50 µL，15.28 mg/mLFigure 5. (a) Absorption spectra of EDC, GQDs, GQDs/EDC, and excitation spectrum of GQDs/EDC at 460 nm detection wavelength. (b) Absorption spectrum of GQDs and excitation spectrum at 460 nm detection wavelength. Transient PL decay curves of (c) GQDs and (d) GQDs/EDC at different detection wavelengths. The final volume of each sample was 2 mL and EDC content is 50 µL, 15.28 mg/mL另一方面，图5(c)的瞬态荧光光谱表明，GQDs在不同探测波长下的PL瞬态光谱均呈现双指数衰减过程，其中快寿命τ1值的范围为1.69~1.75 ns，是GQDs的本征发光过程。慢寿命τ2为11.88~16.46 ns，可归结于表面或缺陷态发光过程[27]。拟合结果表明，随着探测波长从420 nm变化至530 nm，τ1的权重从39.3% 逐渐增加至76.1%，相应的τ2权重逐渐减小，说明本征发光主要贡献于较长波长的荧光。在GQDs中引入EDC(50 µL)后结果如图5(d)所示。可见各探测波长下的瞬态荧光光谱均为单指数衰减，且GQDs/EDC的荧光寿命在1.58～1.81 ns之间，与未添加EDC前GQDs的快寿命τ1相比没有明显改变。以上结果表明EDC起到了钝化缺陷的作用。
3.3 GQDs/EDC的pH响应特性分析
如第3.2节所述，EDC能够钝化表面缺陷，使GQDs荧光显著提升。本文进而研究了GQDs/EDC对pH环境的响应特性，如图6（彩图见期刊电子版）所示。首先，在360 nm激发光下，调整EDC含量（0~1700 µL），分别测量GQDs/EDC的PL光谱，结果如图6(a)所示。同时，在荧光强度趋势图(图6(b))中发现，当EDC含量在0~900 µL时，荧光强度逐渐增强，并在900 µL时达到最高值。此时荧光量子产率（QY）为52.9%，是单独GQDs (QY=0.2%)的264倍。增加EDC含量至1700 µL，荧光强度逐渐降低。在图6(b)插图中的拟合结果表明，当EDC含量在0~100 µL范围内时，荧光强度随EDC含量呈线性增加。在后续实验中选取线性增强区间的中间值，即EDC为50 µL，此时GQDs/EDC的QY=12.1%。在pH响应实验中，将GQDs/EDC分别溶解于pH值为7.20和2.30 的PBS (0.01 M)溶液中，反应后测得荧光积分强度随时间变化数据如图6(c)所示。可见，在小于1 min的反应时间内，荧光即得到迅速增强。随后5~20 min内，荧光强度逐渐趋于稳定。同时，相较于pH值为7.2中性条件，pH值为2.3时的荧光强度降低约24%。故在后续实验中设定反应时间为10 min。
图 6 （a）GQDs分别与浓度为0~1700 µL的EDC混合反应后的荧光光谱以及（b） 荧光积分强度随EDC含量的变化趋势图。（c）pH值分别为7.2和2.3条件下，荧光积分强度随GQDs与EDC反应时间的变化关系Figure 6. (a) Fluorescence spectra of GQDs/EDC with different EDC contents (0−1700 µL), and (b) the trend of fluorescence integrated intensity with EDC content. (c) The integrated PL intensity varies with the reaction time of GQDs/ EDC with the pH value of 7.2 and 2.3, respectively进一步实验中，详细考察了GQDs/EDC材料的pH响应特性，结果如图7（彩图见期刊电子版）所示。如图7(a)所示，pH在 1.76~11.29范围内变化，荧光逐渐增强。图7(b)的荧光峰积分强度结果显示，荧光强度变化趋势在较低pH值区间较为陡峭，随后趋于平缓。线性拟合结果表明其具有两个pH线性相关区间。当pH值在1.76~4.01区间内时，荧光强度变化趋势随pH增加呈线性增加(第一个线性区间)，R2=0.991。之后当pH值在4.01~9.28范围内时，具有第二个线性区间，R2=0.970。并且，在pH值从1.76逐渐增加至11.29的过程中，PL峰强度增强约5.5倍。当pH值在10.65~13.01区间内继续增加，GQDs/EDC的荧光迅速淬灭。这可能是由于EDC在强碱性环境中的化学性质发生了变化，导致其对GQDs荧光的增强效果消失。因此，在pH值大于9.28 的环境中，该方法可能不适用。以上结果体现了GQDs/EDC的pH传感应用潜力，表1列举了近期关于碳和量子点纳米材料pH传感研究的相关报道。研究发现，多数方法在约中性pH值区间表现出响应特性，这满足了生理pH值的应用要求。此外，一些研究还验证了这些方法在生物细胞等样品中的应用结果。然而，针对酸性pH值区间的报道较少。本文的结果表明，相比于pH值范围在4.01~9.28内，GQDs/EDC在pH位于强酸性（1.76~4.01）区间内具有更大的线性变化斜率，表明其在酸性pH值区间内的灵敏性相对更高。同时，本方法对于碱性pH值区间的响应能力，以及在生物细胞内的应用研究需进一步完善。
图 7 不同pH环境下的GQDs/EDC混合反应10 min后测得的（a）荧光光谱(λex=360 nm)和（c）吸收光谱。以及去基线后（b）荧光积分强度和（d）吸收积分强度随pH值的变化曲线。以及不同pH环境下GQDs/EDC的（e）明场和365 nm光源激发下的（f）暗场实物图Figure 7. (a) Fluorescence spectra (λex=360 nm) and (c) absorption spectra of EDC and GQDs at different pH values after 10 min mixed reaction. (b) Integrated fluorescence and (d) absorption intensity as a function of pH value, after removing the baseline. (e) Bright-field and (f) dark-field images of GQDs/EDC under different pH environments with excitation by a 365 nm light source表 1 不同方法的量子点荧光法测定pH值比较结果Table 1. Comparison of pH values of quantum dots by different fluorometric determination methodsSensors Medium Linear range Ref N,S co-doped carbon QDs Intracellular 5.5~7.0 [28] Carbon dots Intracellular 6.1~7.8 [29] Carbon dots Intracellulat 6.03~8.91 [30] N-doped GQDs Aqueous solution 1.25~13.56 [31] CMC/GODs Hydrogels film Not given [32] GQDs Intracellular Not given [33] CuInS2/ZnS ODs Aqueous solution 5.7~8 [34] GODs Aqueous solution 1.76~4.01
4.01~9.28This work 同时，GQDs/EDC的吸收光谱同样展现了pH值响应特性。如图7(c)所示，GQDs吸收峰在362 nm时，随pH值增加，吸收峰强度逐渐增强。在图7(d)中，300~450 nm波长范围内吸收峰积分强度展现出与荧光强度类似的变化趋势和线性相关性。这表明在GQDs/EDC的pH值传感中可以同时利用PL和UV-Vis光谱，实现更可靠的结果。图7(e)和图7(f)分别为不同pH值下GQDs/EDC的实物图和在365 nm紫外灯激发下的荧光图。结果表明不同pH环境下，其荧光具有可视觉分辨性。
值得注意的是，改变GQDs/EDC中EDC的含量(0~90 µL)后，从EDC为10 µL时，瞬态光谱即为单指数衰减(图8(a)(彩图见期刊电子版))。说明此时GQDs缺陷已钝化完全，因此，在图8(a)、8(b)中，瞬态光谱均为单指数衰减，这并不受EDC继续增加或GQDs/EDC所处的pH环境而改变。然而上述图6，图7的PL结果表明，GQDs的荧光却会随EDC增加而继续增强，也会随一定范围内pH值的改变成线性变化。这意味着，EDC因钝化缺陷导致荧光增强不是其影响PL的唯一原因。据报道，对于GQDs等碳元素纳米材料，其荧光特性不但受其面内共轭结构和表面态影响，还会受到溶剂和聚集状态等因素的影响[35]。
图 8 （a）不同EDC含量及（b）不同pH值条件时GQDs/EDC的瞬态荧光衰减曲线Figure 8. (a) Transient fluorescence attenuation curves of GQDs/ EDCs under different EDC contents and (b) different pH conditions例如Tachi S等人证明苯甲醇的酯化反应会限制GQDs边缘官能团的旋转和振动，从而提高GQDs的量子产率[36]。Zhang L等人发现葡萄糖与两个硼掺杂石墨烯量子点（BGQDs）的表面基团反应会产生结构刚性的聚集体，并极大地提高PL强度[37]。因此，分析认为，EDC与GQDs表面羧基的活化反应改变了GQDs的分子振动和转动状态，提高了溶液中材料的结构刚性，导致在EDC钝化GQDs缺陷之后，其含量增加，从而使得GQDs荧光继续增强。
对于pH值响应原理，EDC在交联实验中通过活化一端的表面羧基，之后与另一端的伯胺形成酰胺键实现分子间的共轭。同时，EDC的活化效率会受到溶液pH值影响。通常EDC最佳pH值反应条件为4.5，直至中性pH值为 7.2，此时虽然效率降低但仍满足反应条件[38]。这一条件可以与本工作中的pH值响应区间接近，既GQDs/EDC在1.75~4.01的酸性条件下，pH值响应具有较高灵敏性的线性关系，随后在接近中性pH值时PL强度变化趋于平缓。因此，由以上实验结果和报道可知EDC反应活性受pH环境影响故可实现GQDs/EDC的pH值检测。
为验证GQDs/EDC的pH响应的选择性，选取浓度为5 mM 的Al3+, Cu2+, Zn2+等阳离子以及Br−，F−，CO32-等阴离子进行实验。发现与空白组仅PBS (pH 7.2) 中的GQDs/EDC相比，Al3+, Cu2+, Cl−和CO32−离子荧光强度分别为空白组的58.6%, 68.1%，64.1%和10.8%(图9(a))。表明在pH值检测时这些离子会造成一定程度的干扰。可能是因为AlCl3会在水中水解，释放氯化氢，改变了溶液pH值。而CuCl2导致的溶液颜色的改变同样可能导致响应偏差。对于Cl−，是因为所用PBS缓冲液本身含有KCl，继续引入更多的Cl− 会显著改变缓冲液的离子强度。同时由于Na2CO3在水溶液中呈强碱性，超出本方法的pH值响应范围，也使得荧光显著淬灭。实际应用中，环境或生物体液中各离子浓度较低，所以其干扰在特定应用中是可接受的。在生物毒性研究中，使用了乳腺癌MCF-7细胞与GQDs/EDC共培养24 h，使用MTT法测量细胞毒性。如图9(b)（彩图见期刊电子版）所示细胞存活率在材料最高浓度500 µg/mL时为74%。在25~300 µg/mL浓度范围，存活率均保持在80%以上，体现了碳纳米材料的高生物安全性。
图 9 （a）选择性测试，GQDs/EDC对H+和其他常用离子 (5 mM)的荧光强度响应，其中Blank组为仅有PBS(pH 7.2)溶液（b）细胞与不同浓度GQDs/EDC共培养24 h后，MTT法测得的MCF-7细胞存活率Figure 9. (a) Selective tests, the fluorescence intensity response of GQDs/EDC to H+ and other commonly used ions (5 mM), the Blank group was only PBS (pH 7.2) solution. (b) The survival rate of MCF-7 cells was determined by MTT method after 24 h co-culture with different concentrations of GQDs/ EDC在实际样品应用研究中，由于该方法在酸性pH值区间具有高灵敏性，选择人工胃液作为研究对象。胃液pH值的变化通常与多种疾病相关，包括胃炎，幽门螺旋杆菌感染等。正常胃液pH值通常保持在1~3之间，而在高于4时胃液杀菌作用降低[39-40]。因此胃液pH值测定对相关疾病的诊断和治疗起到重要作用。表2中的测量结果显示该方法与pH计测量结果基本相符，同时相对标准偏差（RSD） 均小于1.10%，证明了该方法检测的高准确性。以上结果表明，本研究中的GQDs/EDC在实际样品pH值测定方面具有良好应用前景。
表 2 胃液pH值的测定Table 2. Determination of pH value of gastric juicesGastric juice sample pH value RSD (%)b Glass electrodea Proposed methoda 1 1.81±0.01 1.83±0.02 0.92 2 2.13±0.02 2.18±0.01 0.60 3 2.46±0.01 2.39±0.03 1.10 a平均值±标准差(n=3)；b相对标准偏差 4. 结 论
总之，在量子点表面功能性修饰研究中，EDC作为一种常用交联剂，经常被用于活化量子点表面羧基，之后与氨基形成酰胺键实现材料或分子间的偶联。在本工作中，证实了EDC也是一种GQDs荧光增强剂。通过EDC引入前后的光谱数据，分析了GQDs荧光增强机理。激发、吸收光谱以及稳态和瞬态PL光谱表明，一方面EDC引入后，激发态电子缺陷能级弛豫过程消失，GQDs的表面缺陷被钝化。另一方面，EDC在溶液中提升了材料结构刚性，以及对GQDs表面分子振动状态造成的改变也是导致荧光增强的可能原因。pH环境对GQDs/EDC荧光的影响实验表明，荧光和吸收强度随pH值的变化具有线性关系，线性区间为pH 1.75~4.01及4.01~9.28。响应的原因是，EDC活化反应效率受pH环境所影响。细胞共培养后，当GQDs/EDC在300 µg/mL以下，细胞存活率均保持在80%以上，表明了其低生物毒性。实际样品人工胃液pH值测定结果表明，该方法与玻璃电极pH计测量结果差异≤0.07，RSD≤1.10%。表明其具有较高的准确性和灵敏性。而在后续传感器开发工作中，该方法可重复使用性和稳定性等方面仍有进一步改善空间。同时，更深入和系统的交联剂介导下CDs类纳米材料性质分析也应继续被研究。
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图 1 （a）GQDs的TEM图像；（b）尺寸分布柱状图及（c）与JCPDS 75-1621标准对比的GQDs XRD图谱；（d）GQDs/EDC复合材料TEM图像
Figure 1. (a) TEM image of GQDs; (b) histogram of size distribution; (c) XRD pattern of GQDs compared with JCPDS 75-1621 standard; (d) TEM image of GQDs/EDC composites
图 3 （a）EDC，PBS，GQDs和GQDs/EDC的PL光谱及（b）PL光谱的局部放大图
Figure 3. (a) PL spectra of EDC, PBS, GQDs and GQDs/EDC and (b) its local magnification
图 4 不同激发波长下（a）GQDs和（c）GQDs/EDC的荧光光谱，以及不同探测波长下（b）GQDs及（d）GQDs/EDC的激发光谱
Figure 4. Fluorescence spectra of (a) GQDs and (c) GQDs/EDC at different excitation wavelengths, and excitation spectra of (b) GQDs and (d) GQDs/EDC at different detection wavelengths
图 5 （a）EDC，GQDs，GQDs/EDC的吸收光谱，以及460 nm探测波长下GQDs/EDC的激发光谱。（b）GQDs的吸收光谱及其460 nm探测波长下的激发光谱。（c）GQDs和（d）GQDs/EDC在不同探测波长下的瞬态PL衰减曲线。各样品最终体积定容至2 mL，EDC含量为50 µL，15.28 mg/mL
Figure 5. (a) Absorption spectra of EDC, GQDs, GQDs/EDC, and excitation spectrum of GQDs/EDC at 460 nm detection wavelength. (b) Absorption spectrum of GQDs and excitation spectrum at 460 nm detection wavelength. Transient PL decay curves of (c) GQDs and (d) GQDs/EDC at different detection wavelengths. The final volume of each sample was 2 mL and EDC content is 50 µL, 15.28 mg/mL
图 6 （a）GQDs分别与浓度为0~1700 µL的EDC混合反应后的荧光光谱以及（b） 荧光积分强度随EDC含量的变化趋势图。（c）pH值分别为7.2和2.3条件下，荧光积分强度随GQDs与EDC反应时间的变化关系
Figure 6. (a) Fluorescence spectra of GQDs/EDC with different EDC contents (0−1700 µL), and (b) the trend of fluorescence integrated intensity with EDC content. (c) The integrated PL intensity varies with the reaction time of GQDs/ EDC with the pH value of 7.2 and 2.3, respectively
图 7 不同pH环境下的GQDs/EDC混合反应10 min后测得的（a）荧光光谱(λex=360 nm)和（c）吸收光谱。以及去基线后（b）荧光积分强度和（d）吸收积分强度随pH值的变化曲线。以及不同pH环境下GQDs/EDC的（e）明场和365 nm光源激发下的（f）暗场实物图
Figure 7. (a) Fluorescence spectra (λex=360 nm) and (c) absorption spectra of EDC and GQDs at different pH values after 10 min mixed reaction. (b) Integrated fluorescence and (d) absorption intensity as a function of pH value, after removing the baseline. (e) Bright-field and (f) dark-field images of GQDs/EDC under different pH environments with excitation by a 365 nm light source
图 8 （a）不同EDC含量及（b）不同pH值条件时GQDs/EDC的瞬态荧光衰减曲线
Figure 8. (a) Transient fluorescence attenuation curves of GQDs/ EDCs under different EDC contents and (b) different pH conditions
图 9 （a）选择性测试，GQDs/EDC对H+和其他常用离子 (5 mM)的荧光强度响应，其中Blank组为仅有PBS(pH 7.2)溶液（b）细胞与不同浓度GQDs/EDC共培养24 h后，MTT法测得的MCF-7细胞存活率
Figure 9. (a) Selective tests, the fluorescence intensity response of GQDs/EDC to H+ and other commonly used ions (5 mM), the Blank group was only PBS (pH 7.2) solution. (b) The survival rate of MCF-7 cells was determined by MTT method after 24 h co-culture with different concentrations of GQDs/ EDC
表 1 不同方法的量子点荧光法测定pH值比较结果
Table 1. Comparison of pH values of quantum dots by different fluorometric determination methods
Sensors Medium Linear range Ref N,S co-doped carbon QDs Intracellular 5.5~7.0 [28] Carbon dots Intracellular 6.1~7.8 [29] Carbon dots Intracellulat 6.03~8.91 [30] N-doped GQDs Aqueous solution 1.25~13.56 [31] CMC/GODs Hydrogels film Not given [32] GQDs Intracellular Not given [33] CuInS2/ZnS ODs Aqueous solution 5.7~8 [34] GODs Aqueous solution 1.76~4.01
4.01~9.28This work 
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表 2 胃液pH值的测定
Table 2. Determination of pH value of gastric juices
Gastric juice sample pH value RSD (%)b Glass electrodea Proposed methoda 1 1.81±0.01 1.83±0.02 0.92 2 2.13±0.02 2.18±0.01 0.60 3 2.46±0.01 2.39±0.03 1.10 a平均值±标准差(n=3)；b相对标准偏差
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