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荧光共振能量转移(FRET)是一种通过荧光物质间发生非辐射能量转移进行分析的光谱分析法[1-2]。自该理论提出以来，FRET已被广泛应用于农业、医药、司法鉴定和科学研究的各个领域中[3-8]。
近年来，FRET技术在空间分辨率、敏感性方面有很大的提高，根据FRET设计的传感器在生物学研究领域得到广泛应用，如检测生物大分子的构象变化、生物大分子之间的相互作用、生物分子间纳米尺度的距离等[9-12]。研究表明能量供受体的光学性质及传感器的组装方法对FRET传感器的检测性能有至关重要的影响[13]，然而传统的能量供受体(如有机荧光染料、生物材料、镧系元素等)由于荧光强度低、光稳定性弱、对环境敏感、生物相容性较差，并且毒性较大，容易受到生物体内自发荧光和杂散光干扰，导致出现荧光强度下降、生物检测达不到预期目标等缺点，从而限制了FRET传感器的发展与应用[14-19]。
目前，南京工业大学课题组[20]将近红外FRET体系应用于光动力治疗方面进行研究，一定程度上改善了可见FRET体系的缺点，达到了更好的治疗效果，但目前近红外FRET体系作为敏感型探针的研究依然比较缺乏。
本文构建了近红外区域的FRET体系，供体为荧光发射峰在近红外的InP/ZnS量子点，受体为吸收在近红外的荧光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)。弥补了传统可见光量子点在生物应用中的缺陷。同时对该体系进行浓度和细胞微环境pH敏感性检测，结果表明FRET体系的荧光强度可直接反映细胞微环境的酸碱度变化，对体系pH值有较高的检测精度，本研究为FRET体系作为敏感型探针应用于癌症早期诊断提供了理论和实验依据。
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实验试剂：醋酸铟(In(Ac)3)，硬脂酸锌(Zn(St)2)，十二烷基硫醇(DDT)，购于Alfa公司；肉豆蔻酸(MA)，购于TCI公司；1-十八烯(ODE)，购自Sigma公司；二硫代苏糖醇(DTT)，磷化锌(Zn3P2)购买于国药上海试剂公司。氢氧化钠，盐酸以上药品均购于国药试剂。荧光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)，购于武汉斯奈德生命科技有限责任公司。实验所用溶剂如不作特殊说明均用超纯水(HPLC), 购于Alfa公司。DMEM高糖培养液，其中含有10%的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，100 μg/mL的盘尼西林和100 μg/mL的链霉素，均购于Gibco公司。
实验仪器：高精度电子天平(Sartorius，Quintix224-1cn)，磁力搅拌器加热台(Thermo Scientific，Cimarec)，超声清洗器，恒温水浴箱，移液器，紫外-可见-近红外分光光度计(Agilent，Cary 5000 UV-Vis-NIR)，荧光分光光度计(Agilent，Cary Eclipse)，透射电子显微镜，FLS980超快荧光寿命光谱仪，荧光倒置显微镜(DMI3000，Leica，德国)。
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量子点的制备：将0.2 mmol的醋酸铟，0.6 mmol的肉豆蔻酸和15 mL 1-十八烯在氮气保护下保持110 ℃加热1 h，获得In前驱液。将3 mL盐酸(4 M)注入磷化锌，生成的磷化氢气体通入到加热至240 ℃的In前驱液中，获得InP量子点。将0.6 mmol硬脂酸锌溶解于2 mL 1-十八烯中并加热至120 ℃后，将其注入InP量子点溶液中，形成InP/ZnS复合物，最后，将加热至260 ℃的十二烷基硫醇(0.6 mmol)加入InP/ZnS复合物，反应1 h后获得InP/ZnS量子点。
上一步骤中制备了油性的InP/ZnS量子点，我们接下来对油性量子点进行了表面修饰，以便其更好的生物应用，具体修饰方法如下：将1 mL甲醇，1 mL氯仿，4 mL MPA和油性量子点混合搅拌5 min，向搅拌后的混合溶液中加入3%的NH4OH，继续搅拌5 h，获得水溶性InP/ZnS量子点。
FRET体系的构建:将InP/ZnS量子点溶液和Cy7荧光染料摩尔比例1：0、1：0.01、1：0.02、1：0.03、1：0.04和1：0.05混合加入反应样品瓶中，在常温、常压条件下搅拌5 min，对混合溶液进行测定。
荧光光谱测定：在室温条件下，依次取1 mL的量子点与染料构建FRET体系溶液，以600 nm为激发波长，激发和发射狭缝为5 nm，记录620 nm到850 nm波长范围内的发射光谱变化。
傅里叶红外光谱测定：50 ℃下将InP/ZnS量子点，Cy7荧光染料和FRET体系烘干成粉末状备用。分别将3种待测样品与溴化钾粉末以1：10的比例混合后充分研磨，将混合后的粉末进行压片处理，获得待测样品。
MCF-7乳腺癌细胞荧光成像：用于荧光成像的MCF-7乳腺癌细胞在使用前要分种在6孔培养板中。实验前的细胞需培养24 h，密度在60%~70%即可。用于荧光成像的FRET体系样品按照10~20 μg/mL的浓度溶于PBS中(pH=7.2)。向六孔板的每个孔中加入20~40 μL的样品，轻轻摇匀后，在37 ℃，5%CO2环境下培养4 h后，移去培养液，用PBS清洗3遍，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态并进行荧光成像研究。
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由图 1可知，InP/ZnS量子点的发射光谱与Cy7染料的吸收光谱有较大的重叠面积，图中的阴影部分为重叠部分。而InP/ZnS量子点的发射光谱与染料的发射光谱相距较远，最大发射峰值相差60 nm，有效避免了供受体之间的荧光干扰。所以InP/ZnS量子点和Cy7荧光染料符合构建FRET体系的基本条件[21-22]，其中InP/ZnS量子点和Cy7染料分别作为FRET体系的供体和受体。
图 1 InP/ZnS量子点和Cy7荧光染料的吸收和发射光谱对比图
Figure 1. Comparison of absorption and emission spectra of InP/ZnS quantum dots and Cy7 fluorescent dyes
根据实验室经验，供体InP/ZnS量子点表面游离的羧基(—COOH)能与受体染料Cy7表面游离的氨基(—NH2)通过化学键和的方式相连接，以拉近供受体之间的距离。为了验证该结论，我们利用傅里叶红外光谱测试(FTIR)对InP/ZnS量子点与染料Cy7之间化学键合的情况进行验证。在图 2中，InP/ZnS量子点溶液在1 650 cm-1(COO—)处有振动峰的存在，Cy7染料在3 438 cm-1(NH2)处有振动峰存在。供体InP/ZnS量子点与受体Cy7染料的结合是通过Cy7上的—NH2和量子点表面的—COOH(来自于量子点的表面修饰剂MPA)，脱水缩合形成的肽键(—CO—NH—)。图 2中曲线1代表了InP/ZnS量子点和Cy7染料构建的FRET体系，InP/ZnS-Cy7染料在1 576 cm-1(—CO—NH—)处的振动峰存在，确定了两种样品成功结合，这个1 576 cm-1的振动峰在InP/ZnS量子点和Cy7单独的红外光谱中均不存在。而且，伴随着1 576 cm-1(—CO—NH—)的出现InP/ZnS量子点上的1 650 cm-1(COO—)振动峰明显减弱，这进一步确认了InP/ZnS量子点与Cy7染料之间的化学键合过程的成功实现。
图 2 InP/ZnS量子点，Cy7，FRET体系的FTIR光谱
Figure 2. FTIR spectra of InP/ZnS quantum dots, Cy7 fluorescent dyes and FRET system
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不同浓度的InP/ZnS量子点与Cy7染料构建FRET体系。如图 3(a)所示，当Cy7染料浓度不变时，随着量子点浓度的增加(0.1~0.5 μmol/L)，Cy7染料的荧光强度会明显增强，可以看出量子点与染料之间发生了荧光共振能量转移。随着供体InP/ZnS量子点浓度的增加，FRET体系的荧光共振能量转移效率逐渐减小，如图 3(b)所示，这是因为随着供体分子数量的增多，围绕在单个供体附近的受体分子平均数目减少，体系的荧光共振能量转移效率减少。本论文转移效率是基于荧光强度计算的，Styrer和Haugland给出[23]，
(1) 
图 3 改变InP/ZnS量子点浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率
Figure 3. FRET system when the InP / ZnS quantum dot concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency
式中，ID-A、ID分别代表有受体和无受体时供体的荧光强度。这样，通过测量供体的荧光强度可以计算出荧光共振能量转移的效率E。
同理，保持量子点浓度不变，改变Cy7染料的浓度，获得FRET体系的变化情况如图 4所示。从图 4(a)中可以看出，随着Cy7染料浓度的增加，量子点的荧光强度随之减小。通过公式(1)，计算得到了改变Cy7染料后的荧光共振能量转移效率，如图 4(b)所示。从图 4(b)中可以看出，随着受体浓度的增加，FRET体系能量转移效率逐渐增大，但当QDs：Cy7小于1：250后，荧光共振能量转移效率达到最大，因为当Cy7染料浓度增加到一定程度时，量子点周围围绕的受体染料分子供数目达到饱和。
图 4 改变Cy7浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率
Figure 4. FRET system when the Cy7 concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency
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如图 5所示，将Cy7染料和InP/ZnS量子点分别溶在pH值为4、7、10、12的去离子水中进行荧光光谱的测试。从图 5(a)中可以看出，随着溶液pH值从4升至12，溶液中染料的荧光强度没有明显的改变，可以说明染料本身对pH值不敏感。但从图 5(b)可以明显看出，随着溶液pH值的改变，量子点的荧光强度有明显的变化，强酸性条件下，量子点的荧光强度最弱，这是因为溶液中较为丰富的H+抑制了量子点表面羧基的解离。相反当溶液偏碱性时，其中会有含有丰富的OH-，能够促进羧基的解离，但过高的pH值同样会降低量子点的荧光。
图 5 Cy7(a)和InP/ZnS量子点(b)在不同pH值溶液中的荧光光谱图
Figure 5. Fluorescence spectra of Cy7(a) and InP/ZnS quantum dots(b) in different pH solutions
测试了供受体对pH值的响应之后，通过调节FRET体系(InP/ZnS-Cy7)的pH值，验证该体系的对pH值的敏感性。癌细胞形成初期表现是pH值的微弱改变，因此，本文拟利用自行构建的FRET体系对pH值的敏感性实现对不同pH值缓冲液的监测，最终应用于癌细胞微环境检测，实现癌症早期诊断。如图 5所示，验证了pH值的微弱改变(pH=6.7~9.1)对体系的荧光强度的影响。在一定范围内，pH值的降低，体系的荧光强度逐渐减弱，呈现出明显趋势，实验结果表明该体系可以作为pH值敏感型生物探针。
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为了验证InP/ZnS-Cy7体系生物应用的可行性，首先采用MTT比色分析法对体系的细胞毒性进行测试，具体测试过程如下：
图 6 FRET体系在不同pH值溶液中的荧光光谱图
Figure 6. Fluorescence spectra of FRET system in different pH solutions
利用96孔板培养MCF-7乳腺癌细胞，FRET体系按照浓度梯度为4、2、1、0.5和0.25 nmol/mL溶解，向孔中分别加入不同浓度的待测样品，摇匀后置于CO2培养箱(37 ℃)中培养24 h，确保样品进入细胞并对细胞产生作用。24 h后，取出含有样品的96孔板，向每个孔中加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL，摇匀后再培养4 h，活细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒。抽取孔上层溶液后加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO，购于Sigma)，利用酶标仪在495 nm处对其进行扫描，得到细胞活性数据。如图 7所示，24 h后，随着InP/ZnS-Cy7体系浓度的增加，细胞活性虽然有所降低，但总体细胞活性均保持在60%以上，具有良好的生物兼容性，可以进行相关的生物研究和应用。
图 7 FRET体系的细胞毒性测试
Figure 7. Relative cell viability of MCF-7 breast cancer cell treated with FRET system
为了证明该体系可以作为荧光探针对生物微环境进行检测，便于未来应用于癌症的早期诊断研究中。我们应用所构建的近红外荧光探针对不同的细胞微环境进行了检测，分别采用高糖培养基(DMEM)、50%密度的巨噬细胞(RAW 264.7)培养48 h后的含有代谢产物的细胞外液、50%密度的MCF-7乳腺癌细胞培养48 h后的含有代谢产物的细胞外液作为检测溶液，测试所获的荧光光谱如图 8所示。可以明显看到，探针的荧光随着细胞外液酸碱度的变化而产生明显变化，通过与精确pH试纸(MN, MACHEREY-NAGEL, 德国)比对，该FRET体系对细胞微环境pH值检测精度可达到0.1，在乳腺癌细胞外液中的FRET体系的荧光强度最弱。
图 8 FRET体系对不同细胞微环境的检测
Figure 8. Detection result of different cell microenvironment by FRET system
量子点良好的荧光信号决定了所构建的FRET体系除了能够实现癌细胞的pH值敏感度检测外，还能够实现癌细胞的荧光标记。图 9显示了FRET体系对MCF-7乳腺癌细胞的成像实验。从明场图像可以看出对照组和实验组细胞生长状态良好，细胞形态正常，呈不规则多边形，没有发现细胞形态的变化，或细胞壁破损的情况，说明该FRET体系毒性较低。通过暗场荧光图可以看出，相比对照组，实验组的细胞内具有来自于FRET体系的明显荧光信号，证明该FRET体系可作为荧光探针对乳腺癌进行荧光标记。
图 9 FRET体系对MCF-7乳腺癌细胞的荧光标记
Figure 9. Fluorescently label in MCF-7 breast cancer cells by FRET system
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本文采用近红外InP/ZnS量子点与近红外Cy7染料构建FRET体系，通过改变体系中量子点和Cy7染料的浓度对FRET体系转移效率的影响进行了讨论分析。最后，研究了不同pH值溶液对FRET体系的影响，结果显示Cy7染料本身对pH值并不敏感，FRET体系对pH值的敏感性主要源于量子点对pH值的敏感性，当溶液pH值处在7~10时，FRET体系具有较高的FRET转移效率。细胞测试结果表明，FRET探针的荧光信号随着细胞外液酸碱度的变化而产生明显变化，可用于生物微环境中对癌细胞的检测。同时，乳腺癌细胞外液中的FRET体系的明显荧光信号可以应用于癌细胞成像，实现了FRET体系的双重功能。
Construction and application of FRET biological probe based on near infrared InP/ZnS quantum dots
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摘要:
本论文构建了基于近红外量子点InP/ZnS和Cy7（C45H44K3N3O16S4）的荧光共振能量转移（FRET）体系，完成了不同pH值和不同浓度下的FRET体系转换效率的检测。检测结果显示：当量子点浓度保持不变时，随着染料浓度的增加，体系转换效率也随之增加，当InP/ZnS量子点与Cy7浓度比为1:250时，转换效率高达68%。细胞测试结果表明，FRET体系对pH值有较高敏感度，对细胞微环境pH值的检测精度可达0.1，该体系可以作为敏感型FRET探针用于生物微环境检测。
Abstract:In this paper, a kind of fluorescence resonance energy transfer(FRET) system based on near infrared InP/ZnS Quantum Dots and fluorescence dye Cy7 was constructed, and the conversion efficiencies of FRET system at different pH values and different concentrations were measured. Experimental results indicated that when the concentration of quanium dots remained constant, the conversion efficiency of the system increased with the increasing of the concentration of dye. When the concentration ratio of InP/ZnS and Cy7 was 1:250, the conversion efficiency was 68%. The results of cell test showed that the FRET system had a high sensitivity to pH value, and the detection accuracy of pH value for cell microenvironment was 0.1, which could be used as a sensitive FRET probe for biological microenvironment detection.
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Key words:
- quantum dots /
- FRET /
- near infrared /
- pH sensitive
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图 1 InP/ZnS量子点和Cy7荧光染料的吸收和发射光谱对比图
Figure 1. Comparison of absorption and emission spectra of InP/ZnS quantum dots and Cy7 fluorescent dyes
图 2 InP/ZnS量子点，Cy7，FRET体系的FTIR光谱
Figure 2. FTIR spectra of InP/ZnS quantum dots, Cy7 fluorescent dyes and FRET system
图 3 改变InP/ZnS量子点浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率
Figure 3. FRET system when the InP / ZnS quantum dot concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency
图 4 改变Cy7浓度时的FRET体系(a)荧光光谱图(b)相应的FRET转换效率
Figure 4. FRET system when the Cy7 concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency
图 5 Cy7(a)和InP/ZnS量子点(b)在不同pH值溶液中的荧光光谱图
Figure 5. Fluorescence spectra of Cy7(a) and InP/ZnS quantum dots(b) in different pH solutions
图 6 FRET体系在不同pH值溶液中的荧光光谱图
Figure 6. Fluorescence spectra of FRET system in different pH solutions
图 7 FRET体系的细胞毒性测试
Figure 7. Relative cell viability of MCF-7 breast cancer cell treated with FRET system
图 8 FRET体系对不同细胞微环境的检测
Figure 8. Detection result of different cell microenvironment by FRET system
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