止血是医院各科室手术中的一个重要环节，对于手术的成功和患者的安危起着重大的作用。壳聚糖因具有抗菌、止血、促进伤口愈合等性质使其成为止血敷料的重要选择^[1-3]。近年来通过复合一些有止血消炎效果的药物或离子来提高止血材料的止血效果成为当前和未来止血敷料的发展趋势^[4-5]。Ong等人^[6]将多磷酸盐(前止血剂)作为止血剂佐剂，结合抗菌素对壳聚糖止血敷料进行改进，与壳聚糖相比，可加速凝血、促进血小板粘附。

纳米壳聚糖因其微粒尺寸的特殊性^[6-7]，较壳聚糖具有更好的水溶性、生物可降解性，可促进细胞生长，其止血作用较壳聚糖更加优秀^[8-9]。由于Ca²⁺具有凝血辅助作用，纳米壳聚糖中加入Ca²⁺能增强止血效果^[10-11]，Ag⁺能通过缓释技术使微生物蛋白质结构遭到破坏使微生物死亡达到抗菌效果^[12-13]。纳米壳聚糖复合止血辅助因子的止血研究尚未见诸文献报道。本文将壳聚糖分子纳米化，制得纳米壳聚糖，再与硝酸银和氯化钙溶液充分反应，得到纳米壳聚糖复合止血材料。采用FTIR、XRD、SEM等手段表征其结构并考察其凝血、止血性能。初步证明纳米壳聚糖络合了Ag⁺和Ca²⁺生产了新的复合物，且较纳米壳聚糖具有良好的止血性。

壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司)、硝酸银(北京化工厂)、冰乙酸(天津市福晨化学试剂厂)、二水合氯化钙(阿拉丁化工厂)、过氧化氢(河北建宁药业有限公司)、恒温水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)、电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。昆明鼠(生物实验用)。

纳米壳聚糖：称取2.0 g壳聚糖向其中加入2%的冰乙酸溶液至完全溶解，加入质量分数为3%的H₂O₂溶液继续反应2 h后向其中加入三聚磷酸钠溶液，反应，直至分散液出现乳光状态，制得纳米壳聚糖溶液放入鼓风干燥箱中干燥，研磨成粉。

纳米壳聚糖银止血粉：称取一定量纳米壳聚糖溶入1%乙酸溶液中，再加入0.10 mol/L的AgNO₃溶液，加热搅拌2 h。放入鼓风干燥箱中干燥，研磨成粉。

纳米壳聚糖钙止血粉：称取一定量纳米壳聚糖溶入1%乙酸溶液中，再加入饱和CaCl₂溶液加热搅拌2 h，烘干，研磨成粉。

纳米壳聚糖银-钙复合材料：称取一定量纳米壳聚糖溶入1%乙酸溶液中，加入0.10 mol/L的AgNO₃溶液充分反应，再向其中加入饱和CaCl₂溶液加热搅拌2 h，烘干，得到成品。

红外光谱(FT-IR)：在傅里叶变换红外光谱仪上，使用KRS-5型ATR探头，用反射法在500~4 000 cm^-1波数范围内扫描^[14]，并记录各样品的红外光谱。

射线衍射光谱(XRD)：室温下使用Rigaku D/MAX-RB型X射线衍射仪记录样品的X射线衍射图谱。X射线源为Cu-Kα线，电压为40 kV，电流为50 mA，DS/SS为0.5，扫描角度10°~80°，扫描速度为10°/min。

扫描电镜(SEM)：为了更好观察混合金属离子，所以将样品铺成膜。用Quanta-200扫描电镜观察膜表面。

样品的凝血、止血性能测试：为了测试实验样品的凝血和止血性能，本文建立了动物实验模型，选用成年雄性昆明鼠体重在18~26 g之间，进行样品的体外凝血和止血实验。

CS和nmCS的红外光谱如图 1所示：CS与TPP作用后，3 423 cm^-1处的O-H伸缩振动吸收峰移至3 429 cm^-1处，向高波数偏移，表明形成了较强的分子内和分子间氢键；1 652 cm^-1处尖峰消失，1 647 cm^-1出现了尖峰，并且1 96 cm^-1的吸收峰向低处偏移36 cm^-1，这一结果与TPP交联的壳聚糖纳米粒子和经磷酸盐修饰后的壳聚糖的结果相似，说明磷酸盐已经连接到了氨基位点上；壳聚糖的1 261 cm^-1处的游离羟基峰在纳米壳聚糖中变弱，这说明游离的羟基峰在纳米粒子中形成了分子间氢键。此外，在1 344~1 097 cm^-1处出现了一系列峰，这是由于P-O键的伸缩振动吸收引起的；在1 000~850 cm^-1处出现峰是由于P-O键弯曲振动吸收引起的，表明生成了纳米壳聚糖。反应如下：

图  1  CS和nmCS的红外光谱图

Figure 1.  FT-IR spectra of chitosan(a) and nm chitosan(b)

nmCS复合Ag⁺、Ca²⁺红外光谱如图 2所示。

图  2  nmCS复合Ag⁺、Ca²⁺的红外光谱图

Figure 2.  FT-IR spectra of nm Chitosan composite Ag⁺, Ca²⁺

(1) nmCS复合Ag⁺后:①nmCS羟基的伸缩振动吸收宽峰发生了波数移动，吸收峰由原来的3 429 cm^-1变为3 419 cm^-1，表明O-H与Ag⁺产生了较强的氢键作用；②壳聚糖吡喃环上的醚键伸缩振动吸收峰向低处偏移，吸收峰由原来的1 097 cm^-1变为1 074 cm^-1。表明Ag⁺与吡喃环上的醚键发生了相互作用。

(2) nmCS复合Ca²⁺后:①-NH₂、-CH₃伸缩振动峰发生了移动，吸收峰由原来的1 409 cm^-1变为1 454 cm^-1，表明-NH₂、-CH₃与Ca²⁺产生了较强的氢键作用；②壳聚糖吡喃环上的醚键伸缩振动吸收峰向低处偏移，吸收峰由1 097 cm^-1变为1 074 cm^-1。表明Ca²⁺与吡喃环上的醚键发生了相互作用。

CS和nmCS的XRD如图 3所示：壳聚糖降解前的特征峰为19.48，降解后的特征峰为21.92，峰位置变化不大，说明降解前后壳聚糖的基本结晶结构没有发生改变。但降解后壳聚糖的衍射强度略有下降，说明降解后壳聚糖的结晶度有所降低。

图  3  CS和nmCS的XRD图

Figure 3.  XRD spectra of chitosan(a) and nm chitosan(b)

nmCS复合Ag⁺、Ca²⁺的XRD如图 4所示：nmCS只在2θ=21.92°处出现衍射吸收峰，单质银的特征峰2θ=38.2°、44.4°、64.6°、77.6°。当nmCS复合Ag⁺时2θ=23.84°、32.32°、46.28°、55.12°、76.4°处出现吸收峰，nmCS和单质银的特征吸收峰均发生了偏移，表明Ag⁺经分子间的氢键作用合成了纳米CS-Ag，当nmCS复合Ca²⁺时其在2θ=27.24°、31.52°、45.24°、56.48°、66.28°、75.24°处出现衍射峰，该结果表明，nmCS复合了Ca²⁺合成了新物质nmCS-Ca。

图  4  nmCS复合Ag⁺、Ca²⁺的XRD图

Figure 4.  XRD spectra of nm Chitosan composite Ag⁺, Ca²⁺

纳米壳聚糖、Ca-纳米壳聚糖和银-纳米壳聚糖的扫描电镜图分别由由图 5(a)、5(b)、5(c)所示，纳米壳聚糖颗粒成球状，粒径约为80 nm，发生粘连。

图  5  nmCS、Ca-nmCS及Ag-nmCS扫描电镜图

Figure 5.  SEM micrographs of nm Chitosan composite Ag⁺、Ca²⁺

通过图 5可以看出，nmCS-Ag的扫描电镜中有些许的析出，原因是硝酸银本身性质的不稳定，见光易分解析出单质银。nmCS-Ca的扫描图片显示nmCS和Ca²⁺的复合很好，基本没有析出。

样品的凝血性能测试方法：向每个试管中加入1 mL 0.10 mol/L草酸钾溶液作为抗凝剂备用。从小白鼠静脉取血5 mL放入试管中后按每毫升血液加入0.2 g样品粉末，每个样品测试3组平行数据，取平均值。每隔数秒倾斜试管，发现血液凝集立即记录时间，结果见表 1。

由此可见，Ag-Ca-nmCS的凝血效果要优于Ag-nmCS和Ca-nmCS，其中Ca-nmCS的凝血效果要优于Ag-nmCS，同时Ag-nmCS和Ca-nmCS的凝血效果要好于CS和nmCS的凝血效果。

样品的止血性能测试方法：将小鼠放进离心管中使其头部固定，于尾尖5 cm处切断，制造出血创面。空白对照实验将尾尖在自然状态下止血，从切断尾尖开始，到不再有血滴渗出，记录止血时间，分别测试3组平行数据，计算平均值；另外5组样品，在切断小鼠尾尖后，取0.2 g样品均匀涂抹于伤口，使尾部保持自然状态不动，使伤口与样品始终接触，从切断尾尖开始，直到不再出血为止，记录止血时间，5个样品分别测试三组平行数据，计算平均值(表 2)。

从平均止血时间来看，Ag-Ca-nmCS的止血效果要优于Ag-nmCS和Ca-nmCS，其中Ca-nmCS的止血效果要优于Ag-nmCS同时Ag-nmCS和Ca-nmCS的止血效果要好于CS和nmCS的止血效果。

(1) 壳聚糖经纳米化制得纳米壳聚糖向其中加入Ag⁺和Ca²⁺制得纳米壳聚糖复合止血材料。

(2) 对样品进行结构和性能表征，研究发现：加入了Ag⁺和Ca²⁺的纳米壳聚糖其IR图谱显示在1 647 cm^-1和1 560 cm^-1处出现了纳米壳聚糖钠盐的特征吸收峰，XRD图谱表现出相应晶型，以上说明Ag⁺和Ca²⁺成功与纳米壳聚糖复合。SEM图像可以看出Ca-nmCS的复合效果好于Ag-nmCS。

(3) 添加了Ag⁺和Ca²⁺的纳米壳聚糖可以有效地缩短凝血和止血时间，其中分别单独添加Ag⁺和Ca²⁺制备出的止血粉相比，添加Ca²⁺制备的止血粉其止血效果要稍好于添加Ag⁺制备的止血粉。同时添加Ag⁺和Ca²⁺制备的止血粉，在复合效应作用下获得了更优的凝血和止血性能。