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同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制

张红彩 刘保生 程旭

张红彩, 刘保生, 程旭. 同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制[J]. 中国光学. doi: 10.3788/CO.2019-0112
引用本文: 张红彩, 刘保生, 程旭. 同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制[J]. 中国光学. doi: 10.3788/CO.2019-0112
ZHANG Hong-cai, LIU Bao-sheng, CHENG Xu. Study on the Binding Mechanism of Cefoxitin Sodium to Lysozyme by Synchronous Fluorescence Spectroscopy[J]. Chinese Optics. doi: 10.3788/CO.2019-0112
Citation: ZHANG Hong-cai, LIU Bao-sheng, CHENG Xu. Study on the Binding Mechanism of Cefoxitin Sodium to Lysozyme by Synchronous Fluorescence Spectroscopy[J]. Chinese Optics. doi: 10.3788/CO.2019-0112

同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制

doi: 10.3788/CO.2019-0112
基金项目: 国家自然科学基金项目(No.21375032)
详细信息
    作者简介:

    张红彩(1993—),女,河北石家庄人,硕士研究生,2017年于保定学院获得学士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:1179497976@qq.com

    刘保生(1963—),男,河北省保定人,硕士学位研究生学历,职称研究员,1986年于河北大学获得分析化学专业学士学位、1992年于河北大学获得分析化学专业硕士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn

    通讯作者: 刘保生(1963-),男,河北省保定人,硕士学位研究生学历,职称研究员,1986年于河北大学获得分析化学专业学士学位、1992年于河北大学获得分析化学专业硕士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn
  • 中图分类号: O657.3

Study on the Binding Mechanism of Cefoxitin Sodium to Lysozyme by Synchronous Fluorescence Spectroscopy

Funds: Supported by National Natural Science Foundation of China (No. 21375032)
More Information
  • 摘要: 在模拟生理学条件下(pH=7.40),采用同步荧光法研究了头孢西丁钠(CFXS)和溶菌酶(LYSO)中的荧光基团酪氨酸(Tyr)残基、色氨酸(Trp)残基之间的相互作用。结果表明:CFXS以静态猝灭的方式猝灭LYSO中的Tyr、Trp残基的荧光,结合位点数n≈1。310 K时Tyr与Trp残基反应的荧光猝灭比率份数NSFQR(Trp)(60.25%)>NSFQR(Tyr)(39.75%),结合位置更靠近Trp残基。Hill系数nH约为1,表明CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合不会影响后继配体与蛋白质的结合。CFXS与LYSO中Tyr残基的药物结合率W(Q)=0.19%~0.13%,Trp残基的药物结合率W(Q)=0.23%~0.14%,游离的药物含量几乎不变,表明CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合基本不影响药物的疗效;Tyr残基的蛋白结合率W(B)=52.69%~54.67%,Trp残基的蛋白结合率W(B)=67.67%~69.39%,蛋白中游离的氨基酸残基数目会明显降低。CFXS-LYSO结合体系的主要作用力类型是疏水作用,分子对接结果表明CFXS与LYSO之间还存在氢键作用,且两者的最佳结合位置在LYSO的活性中心附近,两者的结合改变了活性中心处的氨基酸残基的微环境。
  • 图  1  CFXS-LYSO体系的同步荧光光谱 (T=310 K) (A) Δλ=15 nm;(B) Δλ=60 nm

    Figure  1.  Synchronous fluorescence spectra of CFXS-LYSO system (T=310 K) (A) Δλ=15 nm; (B) Δλ=60 nm

    CLYSO=5.0×10−7 mol/L; 1~8: CCFXS=(0, 0.1, 0.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0)×10−5 mol/L

    图  2  CFXS-LYSO体系荧光强度随NaCl浓度的变化 (T=310 K)

    Figure  2.  Fluorescence intensity of CFXS-LYSO system as a function of NaCl concentration (T=310 K)

    CLYSO=5.0×10−7 mol/L, CCFXS=2.0×10−5 mol/L, CNacl=(0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30) mol/L

    图  3  CFXS与LYSO相互作用的分子对接图

    (A) CFXS与LYSO发生作用区域 (B) CFXS与LYSO活化中心发生作用的氨基酸残基

    Figure  3.  Computation docking model of the interaction between CFXS and LYSO

    (A) CFXS located within the hydrophobic pocket in LYSO (B) Detailed illustration of the amino acid residues lining the binding sitein the CFXS and LYSO cavity

    表  1  CFXS-LYSO体系的同步荧光猝灭反应参数

    Table  1.   Synchronous quenching reactive parameters of CFXS-LYSO system

    Δλ(nm)T(K)Ksv(L/mol·s)kq(L/mol)r1Ka(L/mol)nr2
    Δλ=602982.18×1042.18×10120.990 51.73×1041.180.992 2
    3101.61×1041.61×10120.992 41.58×1041.030.991 3
    3181.26×1041.26×10120.994 11.39×1040.960.993 5
    Δλ=152981.33×1041.33×10120.993 80.96×1041.070.995 7
    3101.17×1041.17×10120.991 40.84×1041.170.992 2
    3180.83×1040.83×10120.995 20.68×1041.120.993 4
      r1为方程F0 /F~[L]的线性相关系数;r2为方程lg[(F0-F)/F]~lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的线性相关系数。
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    表  2  不同温度下CFXS-LYSO体系的热力学参数

    Table  2.   Thermodynamic parameters of CFXS-LYSO system at different temperatures

    SystemT/(K)Ka/(L/mol)ΔH/(kJ/mol)ΔS/(J/mol·K)ΔG/(kJ/mol)
    Δλ=15 nm2980.96×104−13.1532.10−22.71
    3100.84×10432.70−23.28
    3180.68×10432.01−23.33
    Δλ=60 nm2981.73×104−11.6841.93−24.17
    3101.58×10442.70−24.91
    3181.39×10442.58−25.22
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    表  3  null残基的Hill系数

    Table  3.   Hill coefficient of CFXS and Tyr and Trp residues in LYSO at different temperatures

    T/KΔλ=60 nmΔλ=15 nm
    nHr3nHr3
    2980.940.993 70.990.997 1
    3101.150.994 81.070.993 3
    3180.920.996 70.940.995 2
      nH为体系的Hill系数;r3为方程lg[Y/(1-Y)]~lg[L]的线性相关系数。
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    表  4  CFXS-LYSO体系的对接能量(单位:kJ/mol)

    Table  4.   Docking energy of CFXS-LYSO system (unit: kJ/mol)

    Protein PDB IDΔG0ΔE1ΔE2ΔE3
    2LYZ−24.81−39.78−36.44−3.34
      ΔG0是CFXS-LYSO的结合自由能。
    ΔE1是分子间相互作用能,它是范德华能,氢键能,去溶剂化自由能和静电能的总和。
    ΔE2是范德华能,氢键能和去溶剂化自由能的总和。
    ΔE3是静电能
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    [20] 张未来, 宋克菲, 王云磊, 潘利华, 马庆军, 汪龙祺, 刘海波.  固相时间分辨荧光免疫分析仪数据采集系统设计 . 中国光学,
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出版历程
  • 网络出版日期:  2020-04-03

同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制

doi: 10.3788/CO.2019-0112
    基金项目:  国家自然科学基金项目(No.21375032)
    作者简介:

    张红彩(1993—),女,河北石家庄人,硕士研究生,2017年于保定学院获得学士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:1179497976@qq.com

    刘保生(1963—),男,河北省保定人,硕士学位研究生学历,职称研究员,1986年于河北大学获得分析化学专业学士学位、1992年于河北大学获得分析化学专业硕士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn

    通讯作者: 刘保生(1963-),男,河北省保定人,硕士学位研究生学历,职称研究员,1986年于河北大学获得分析化学专业学士学位、1992年于河北大学获得分析化学专业硕士学位,主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn
  • 中图分类号: O657.3

摘要: 在模拟生理学条件下(pH=7.40),采用同步荧光法研究了头孢西丁钠(CFXS)和溶菌酶(LYSO)中的荧光基团酪氨酸(Tyr)残基、色氨酸(Trp)残基之间的相互作用。结果表明:CFXS以静态猝灭的方式猝灭LYSO中的Tyr、Trp残基的荧光,结合位点数n≈1。310 K时Tyr与Trp残基反应的荧光猝灭比率份数NSFQR(Trp)(60.25%)>NSFQR(Tyr)(39.75%),结合位置更靠近Trp残基。Hill系数nH约为1,表明CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合不会影响后继配体与蛋白质的结合。CFXS与LYSO中Tyr残基的药物结合率W(Q)=0.19%~0.13%,Trp残基的药物结合率W(Q)=0.23%~0.14%,游离的药物含量几乎不变,表明CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合基本不影响药物的疗效;Tyr残基的蛋白结合率W(B)=52.69%~54.67%,Trp残基的蛋白结合率W(B)=67.67%~69.39%,蛋白中游离的氨基酸残基数目会明显降低。CFXS-LYSO结合体系的主要作用力类型是疏水作用,分子对接结果表明CFXS与LYSO之间还存在氢键作用,且两者的最佳结合位置在LYSO的活性中心附近,两者的结合改变了活性中心处的氨基酸残基的微环境。

English Abstract

张红彩, 刘保生, 程旭. 同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制[J]. 中国光学. doi: 10.3788/CO.2019-0112
引用本文: 张红彩, 刘保生, 程旭. 同步荧光光谱探究头孢西丁钠与溶菌酶的结合机制[J]. 中国光学. doi: 10.3788/CO.2019-0112
ZHANG Hong-cai, LIU Bao-sheng, CHENG Xu. Study on the Binding Mechanism of Cefoxitin Sodium to Lysozyme by Synchronous Fluorescence Spectroscopy[J]. Chinese Optics. doi: 10.3788/CO.2019-0112
Citation: ZHANG Hong-cai, LIU Bao-sheng, CHENG Xu. Study on the Binding Mechanism of Cefoxitin Sodium to Lysozyme by Synchronous Fluorescence Spectroscopy[J]. Chinese Optics. doi: 10.3788/CO.2019-0112
    • 荧光光谱法现在已经成为研究以药物分子为代表的小分子物质与生物大分子物质(如蛋白质、DNA等)相互作用的重要手段。到目前为止,荧光光谱研究小分子化合物与蛋白质类生物大分子作用机理的报道有许多,报道中所采用的研究方法主要是测量激发波长为280 nm与295 nm时蛋白质与药物结合体系的荧光信号的变化情况[1],然而利用同步荧光光谱法进行小分子药物与大分子蛋白质相互作用的研究报道比较少。同步荧光法具有良好的选择性、较高的灵敏度,可减少光谱测量过程中的干扰[2]。此外,通过固定发射与激发波长两者的差值Δλ,得到同步荧光光谱图,根据所得的荧光数据能够得到药物与蛋白质中Tyr与Trp残基的结合常数等一系列实验数据,同时还可以根据同步荧光峰的位移情况判断药物与蛋白质结合过程中蛋白质中Tyr与Trp残基周围微环境的变化情况,从而获得结合体系的数据信息。研究表明,蛋白中游离的Tyr、Trp残基的含量变化与肿瘤的发生发展有密切联系[3]

      头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium,简称CFXS)是常见的抗生素类药物,主要用于治疗细菌感染类疾病[4]。溶菌酶(lysozyme,简称LYSO)相对分子质量约为14 600[5],广泛分布于生物体液和组织中的免疫蛋白,它可以直接与病毒类物质结合,起到治疗炎症的效果[6]。目前已有很多关于LYSO与药物的报道,比如Fang Qing等人[7, 8]利用光谱法研究了喹诺酮类药物左氧氟沙星、氟罗沙星和LYSO的结合机理,Sourav Das等人[9]发现黄酮类化合物柚皮苷以静态猝灭的方式猝灭LYSO的内源荧光,陈晨等人探讨了抗癌药物奥沙利铂与LYSO的作用机制[10],但是采用同步荧光法深入探讨药物与LYSO内荧光基团Tyr与Trp残基的相互作用的研究尚未见报道。因此,本文采用同步荧光法和分子对接技术研究了CFXS与LYSO内荧光基团Tyr与Trp残基的相互作用,得到LYSO中Tyr残基和Trp残基与CFXS结合的相关参数,并采用分子对接技术,探究了CFXS与LYSO的最佳结合模型,从而在更深层次上揭示药物分子和蛋白内氨基酸残基的反应机制,更进一步地了解了蛋白和药物的真实作用情况,为小分子药物和大分子蛋白质的结合研究提供了一定的参考。

    • 仪器:RF-5301PC荧光仪(日本岛津),SYC-15B型超级恒温水浴(南京桑力电子设备厂),SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)

      试剂:LYSO,纯度≥99%,Sigma公司,储备液5.0×10−5 mol/L;CFXS,纯度≥99%,储备液1.0×10−3 mol/L;pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液 (内含0.15 mol/L NaCl,调节生理条件下的离子强度)。实验用水均为二次石英蒸馏水,以上储备液均在277 K下避光保存。

    • 同步荧光光谱测定:分别在298 K、310 K、318 K下,于10.0 mL比色管中分别加入1.0 mL Tris-HCl缓冲溶液,1.0 mL LYSO溶液 (5.0×10−6 mol/L)和不同体积的CFXS溶液,定容,恒温静置30 min。狭缝宽度为5 nm。Δλ=15 nm与Δλ=60 nm,扫描同步荧光光谱。

      分子对接:LYSO的晶体结构(PDB ID:2LYZ)来自蛋白数据库(Protein Data Bank)。CFXS的结构式在ChemDraw Pro 14.0软件中绘制,同时在ChemBio 3D Ultra 14.0软件中对其三维结构进行能量最小化。最后使用AutoDock 4.2.6软件对CFXS和LYSO进行分子对接,主要采用遗传算法来计算CFXS与LYSO结合的可能构象[11]

    • 在实验条件下,设置Δλ=15 nm或者60 nm,对蛋白质分子与药物分子的结合体系进行光谱测定,从而得到结合体系的同步荧光光谱,进而分别呈现蛋白质的Tyr残基与Trp残基的特征信息[12]。通过CFXS-LYSO体系的同步荧光光谱图(图1)可知,随着CFXS不断加入,LYSO中的Tyr残基与Trp残基的荧光信号也随之降低,结果表明LYSO中的Tyr残基与Trp残基参与了CFXS与LYSO的结合作用,谱图的荧光峰发生了微小的红移,意味着两种残基周围的微环境发生了改变。

      图  1  CFXS-LYSO体系的同步荧光光谱 (T=310 K) (A) Δλ=15 nm;(B) Δλ=60 nm

      Figure 1.  Synchronous fluorescence spectra of CFXS-LYSO system (T=310 K) (A) Δλ=15 nm; (B) Δλ=60 nm

      $$ {I_0}/I = 1 + {k_q}{\tau _0}[L] = 1 + {K_{sv}}[L] = 1 + KD[L] $$ (1)
      $$\lg \left( {\frac{{{I_0} - I}}{I}} \right) = n\lg {K_a} + {\rm{n}}\lg \left\{ {\left[ L \right] - n\frac{{{I_0} - I}}{{I0}}\left[ {{B_t}} \right]} \right\}$$ (2)

      I0是未加入CFXS时的荧光强度, I是加入CFXS后的荧光强度。τ0和[L]分别是没有猝灭剂时分子的平均荧光寿命(~10−8 s)和猝灭剂的浓度,通过Stern-Volmer方程(1)[13]得出不同温度下的猝灭速率常数kq以及猝灭常数Ksv,结果见表1Ksvkq与温度呈负相关,并且kq均大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2×1010 L/mol·s[14],说明CFXS与LYSO之间发生了静态猝灭。通过公式(2)[15]对所得的实验数据进行处理进而得到CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合参数,其中,[Bt]表示LYSO的浓度,由表1可知结合位点数n≈1,说明了CFXS与LYSO形成了1:1的复合物。Δλ=60 nm时的结合常数Ka比Δλ=15 nm时的Ka大,说明在CFXS与LYSO的结合过程中,药物CFXS更靠近LYSO的Trp残基,即LYSO中的Trp残基参与的程度更大。

      表 1  CFXS-LYSO体系的同步荧光猝灭反应参数

      Table 1.  Synchronous quenching reactive parameters of CFXS-LYSO system

      Δλ(nm)T(K)Ksv(L/mol·s)kq(L/mol)r1Ka(L/mol)nr2
      Δλ=602982.18×1042.18×10120.990 51.73×1041.180.992 2
      3101.61×1041.61×10120.992 41.58×1041.030.991 3
      3181.26×1041.26×10120.994 11.39×1040.960.993 5
      Δλ=152981.33×1041.33×10120.993 80.96×1041.070.995 7
      3101.17×1041.17×10120.991 40.84×1041.170.992 2
      3180.83×1040.83×10120.995 20.68×1041.120.993 4
        r1为方程F0 /F~[L]的线性相关系数;r2为方程lg[(F0-F)/F]~lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的线性相关系数。

      荧光信号降低的程度常用荧光猝灭比率RSFQ表示,且RSFQ=1−I/I0[16]。当温度与CFXS的浓度相同时,得到RSFQ(Tyr)RSFQ(Trp),两种残基的荧光猝灭比率份数分别为NSFQR(Tyr)=(RSFQ(Tyr))/(RSFQ(Tyr)+RSFQ(Trp))%,NSFQR(Trp)=100%− NSFQR(Tyr)[17]

      T=310 K,LYSO浓度为CLYSO=5.0×10−7 mol/L,CFXS浓度为CCFXS=(0.1,0.5,2.0,4.0,6.0)×10−5 mol/L时,NSFQR(Tyr)分别为49.09%、45.20%、36.55%、34.41%、33.49%,平均值为39.75%;NSFQR(Trp)分别为50.91%、54.79%、63.44%、65.58%、66.50%,平均值为60.25%。数据表明LYSO中的Tyr与Trp均参与了CFXS与LYSO的结合反应,且NSFQR(Trp)>NSFQR(Tyr),也表明LYSO中Trp残基对该结合反应的贡献更大,与结合常数得出的结论一致。

    • CFXS-LYSO体系的热力学参数可以由van't Hoff方程和热力学方程(3)、(4)[18]计算得出:

      $$R\ln K = \Delta S - \Delta H/T$$ (3)
      $$\Delta G = - RT\ln K = \Delta H - T\Delta S$$ (4)

      其中R是气体常数,CFXS和LYSO之间的结合作用的ΔH和ΔS的数值均可以通过结合常数的自然对数(lnKa)和温度的倒数(1/T)之间的线性关系来计算,所得结果列于表2。由表2可知:ΔG小于0,表明CFXS与LYSO的结合反应是自发进行的,Δλ=60 nm处的ΔG值小于Δλ=15 nm处的ΔG值,进一步表明CFXS和LYSO的Trp残基之间的反应趋势更强;ΔH小于0表明CFXS-LYSO复合物的形成过程中伴随着热量的释放,温度升高不利于反应的进行,即温度升高使CFXS与LYSO的结合能力减弱。ΔS>0,水分子的排列以更加有序的方式围绕药物和蛋白质建立更加随机的配置[19],因此可以判断CFXS与LYSO之间存在疏水作用力,且Δλ=60 nm处的ΔS值小于Δλ=15 nm处的ΔS值,CFXS与Trp残基结合时混乱程度更大,即Trp残基更容易与CFXS发生反应。Ross[20]指出,当ΔH约等于0或较小,ΔS大于0时,才可以认为分子间存在静电引力,但部分文献[21]指出,当ΔH小于0,ΔS大于0时,可以直接判断其主要作用力为静电作用力。

      表 2  不同温度下CFXS-LYSO体系的热力学参数

      Table 2.  Thermodynamic parameters of CFXS-LYSO system at different temperatures

      SystemT/(K)Ka/(L/mol)ΔH/(kJ/mol)ΔS/(J/mol·K)ΔG/(kJ/mol)
      Δλ=15 nm2980.96×104−13.1532.10−22.71
      3100.84×10432.70−23.28
      3180.68×10432.01−23.33
      Δλ=60 nm2981.73×104−11.6841.93−24.17
      3101.58×10442.70−24.91
      3181.39×10442.58−25.22

      一般情况下,静电作用力在蛋白质和配体的结合过程中起到辅助作用。但是,如果静电作用力在蛋白质与小分子的结合中起主导作用,则随着体系中盐浓度的增加,其相互作用强度会降低[22]。为了进一步验证CFXS与LYSO之间是否存在静电作用力,本文探讨了离子强度对CFXS-LYSO相互作用的影响。固定CFXS和LYSO的浓度,分别加入不同浓度的NaCl,以I/I0CNaCl作图,结果见图2。实验结果表明,当NaCl浓度升高时,I/I0的比值并未发生明显变化,比值在1左右浮动,表明CFXS与LYSO的结合并不受离子强度的影响,即CFXS-LYSO体系并没有明显的静电作用力,进一步证明了CFXS与LYSO的结合是由疏水作用力驱动的。

      图  2  CFXS-LYSO体系荧光强度随NaCl浓度的变化 (T=310 K)

      Figure 2.  Fluorescence intensity of CFXS-LYSO system as a function of NaCl concentration (T=310 K)

    • 根据同步荧光实验所得Ka值可以分别计算得到CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合的药物结合率和蛋白结合率。当n=1时,CFXS-LYSO体系的结合率(W)公式(5)(6)[23],其中,Q代表CFXS的总浓度,B代表LYSO的总浓度。

      药物结合率:

      $$ \begin{aligned} & W\left( Q \right) =\\ & \frac{{{K_a}\left( {Q + B} \right) + 1 - \sqrt {K{a^2}{{\left( {Q - B} \right)}^2} + 2{K_a}\left( {Q + B} \right) + 1} }}{{2{K_a}Q}}\\ & \times 100\% \end{aligned} $$ (5)

      蛋白结合率:

      $$ \begin{aligned} & W\left( B \right) =\\ & \frac{{{K_a}\left( {Q + B} \right) + 1 - \sqrt {K{a^2}{{\left( {Q - B} \right)}^2} + 2{K_a}\left( {Q + B} \right) + 1} }}{{2{K_a}B}}\\ & \times 100\% \end{aligned} $$ (6)

      CFXS为人常见的注射用头孢菌素,口服不吸收,静脉注射后吸收迅速,当病人静脉注射CFXS 1.0 g时,约5分钟后,达到血药浓度峰值约为60 μg/mL~65 μg/mL (1.33×10−4~1.44×10−4 mol/L),人血浆中LYSO的含量约为7.0×10−7mol/L[24]。利用Δλ=15 nm与Δλ=60 nm (接近人体温度310 K)时实验所得的Ka值并结合公式(5)(6),计算得到此时CFXS-LYSO体系LYSO中Trp残基的药物结合率为W(Q)为0.23%~0.14%,药物游离率为99.77%~99.86%,Tyr残基的药物结合率为W(Q)为0.19%~0.13%,药物游离率为99.81%~99.87%,游离的药物浓度几乎不变,说明CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基的结合基本不影响CFXS的药效。

      CFXS-LYSO体系的Trp残基的蛋白结合率W(B)为67.67%~69.39%,蛋白游离率为32.33%~30.61%;Tyr残基的蛋白结合率W(B)为52.69%~54.67%,蛋白游离率为47.31%~45.33%,表明LYSO与CFXS结合后,LYSO中的游离的Tyr与Trp残基的数量均减少,含量变化相对明显。研究表明,血浆中的Trp残基和Tyr残基的含量的降低是部分癌症病变的标志[3]。小分子物质在人体内与血浆中的蛋白结合,会使人体血浆蛋白中游离的Trp残基和Tyr残基的含量降低,如果小分子物质随着人体代谢很快排出体外,那么人体内血浆蛋白中的游离的Tyr与Trp残基的含量很快会恢复正常,对于人体不会造成大的损害。CFXS的血清半衰期约为0.8 h左右,静脉注射后在体内广泛分布,与蛋白结合,易于渗透细胞、体液、组织和器官,CFXS在人体内几乎不发生代谢,24小时后静脉注射进入人体的80%~90%的CFXS基本都会以原型随尿液排泄[25],因此注射CFXS对于人体本身影响不大。但是如果发生结合作用的小分子物质在人体中代谢周期过长,便会对人体健康造成影响,如苯并芘[26],具有较强的致癌作用。利用同步荧光光谱法讨论结合体系的结合率,可以快速获得两种残基含量的变化情况,可以预测药物分子对人体健康的影响,为药物与蛋白结合的研究在临床应用中提供了一条新的思路。

    • 根据公式(7)(8)(9)[27]利用Hill系数nH对协同作用进行定量分析:

      $$\lg \left\{ {{Y / {\left( {1 - Y} \right)}}} \right\} = \lg Ka + nH\lg [L]$$ (7)

      其中,Ka是不同温度下Tyr与Trp残基的结合常数,Y表示结合饱和分数。

      对于荧光测量:

      $${Y / {\left( {1 - Y} \right) = {Q / {\left( {Qm - Q} \right)}}}}$$ (8)
      $$Q = 1 - I/I0$$ (9)

      其中,1/Q对1/[L]作图的截距为1/Qm,lg{Y/(1−Y)}对lg[L]作图得到的斜率为Hill系数nH,结果显示在表3中。nH大于1时表示第一种配体与后继配体之间为正协同作用即CFXS与LYSO中Tyr与Trp残基结合有利于后继配体与蛋白的结合;nH小于1时表示第一种配体与后继配体之间为负协同作用即CFXS与LYSO中的Tyr与Trp残基的结合不利于后继配体与蛋白的结合;nH等于1时表示第一种配体与后继配体之间为零协同作用即CFXS与LYSO中的Tyr与Trp残基的结合不影响后继配体与蛋白的结合[28]。在不同温度下,nH的值约为1,表明CFXS与LYSO中的Tyr与Trp残基之间不存在协同作用,即CFXS与LYSO中的Tyr与Trp残基的结合不会影响后继配体与蛋白的结合。

      表 3  null残基的Hill系数

      Table 3.  Hill coefficient of CFXS and Tyr and Trp residues in LYSO at different temperatures

      T/KΔλ=60 nmΔλ=15 nm
      nHr3nHr3
      2980.940.993 70.990.997 1
      3101.150.994 81.070.993 3
      3180.920.996 70.940.995 2
        nH为体系的Hill系数;r3为方程lg[Y/(1-Y)]~lg[L]的线性相关系数。
    • 分子对接在研究生物大分子与小分子的结合相互作用机制方面受到越来越多的关注,它在药物发现和开发中发挥着越来越重要的作用。本研究使用Autodock 4.2.6对CFXS-LYSO进行了分子对接分析,得到了两者的最佳结合位置,作用力类型以及最低结合能。

      图3A给出了CFXS与LYSO的最佳结合位置。LYSO中的Asp52,Val109,Arg112残基分别与CFXS分子形成了三个氢键,键长分别为2.136 Å,2.161 Å,1.874 Å,这表明氢键在CFXS与LYSO结合的过程中起到了非常重要的作用。由图3B可以看出,CFXS被Tyr53,Trp62,Trp63,Leu56,Ala110,Ala107,Val109 等多个疏水性氨基酸残基包围,进一步表明CFXS与LYSO结合过程中存在疏水作用力。同时,CFXS与LYSO结合位置靠近由Asp52和Glu35残基组成的活性中心,表明两者的结合会改变LYSO催化活性中心处氨基酸残基的微环境[29]。CFXS的结合位置距离Tyr53,Trp62与Trp63残基很近,说明CFXS与LYSO的结合过程中有Tyr和Trp残基的参与,此结论与同步荧光实验结论相一致。在对接过程中,CFXS-LYSO复合物的最低结合能为ΔG0=−24.81 kJ/mol,与实验得到的ΔG (−24.91 kJ/mol)比较接近,数据结果的差异可能是由于在对接模拟中排除了溶剂或除了氨基酸残基Trp,Tyr之外的受体的刚性[30]。CFXS与LYSO分子对接的具体能量数据见表4。从表中数据可以看出CFXS-LYSO体系静电能远低于CFXS与LYSO结合过程中的范德华能量,氢键能量和去溶剂化自由能之和,结果表明CFXS与LYSO之间的静电作用非常微弱,这也与离子强度对CFXS-LYSO结合的荧光实验的影响结果相一致。

      图  3  CFXS与LYSO相互作用的分子对接图

      Figure 3.  Computation docking model of the interaction between CFXS and LYSO

      表 4  CFXS-LYSO体系的对接能量(单位:kJ/mol)

      Table 4.  Docking energy of CFXS-LYSO system (unit: kJ/mol)

      Protein PDB IDΔG0ΔE1ΔE2ΔE3
      2LYZ−24.81−39.78−36.44−3.34
        ΔG0是CFXS-LYSO的结合自由能。
      ΔE1是分子间相互作用能,它是范德华能,氢键能,去溶剂化自由能和静电能的总和。
      ΔE2是范德华能,氢键能和去溶剂化自由能的总和。
      ΔE3是静电能
    • 在模拟生理条件下,采用同步荧光法探讨了CFXS与LYSO内荧光基团Tyr与Trp残基的结合反应,并结合分子对接技术,了解结合位点周围氨基酸残基的微环境变化情况,此方法对研究蛋白质中Trp和Tyr残基与药物之间的作用机制具有重要的意义。同时,利用这一方法得到的结合常数计算药物与蛋白体系的结合率,预测了CFXS与LYSO中的Tyr与Trp残基的结合对药物的疗效的影响,并且通过Tyr与Trp两种残基含量的变化,简单地预测了药物分子对人体健康的影响,为蛋白和药物的临床研究提供了重要参考。

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