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美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究

程旭 刘保生 张红彩

程旭, 刘保生, 张红彩. 美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究[J]. 中国光学, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
引用本文: 程旭, 刘保生, 张红彩. 美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究[J]. 中国光学, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
CHENG Xu, LIU Bao-sheng, ZHANG Hong-cai. Spectral analysis and theoretical modeling of the working mechanism of meloxicam and lysozyme[J]. Chinese Optics, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
Citation: CHENG Xu, LIU Bao-sheng, ZHANG Hong-cai. Spectral analysis and theoretical modeling of the working mechanism of meloxicam and lysozyme[J]. Chinese Optics, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354

美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究

doi: 10.3788/CO.20201302.0354
基金项目: 

国家自然科学基金资助项目 21375032

详细信息
    作者简介:

    程旭(1993—), 男, 山东潍坊人, 硕士研究生, 2017年于济宁学院获得学士学位, 主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:2547034720@qq.com

    刘保生(1963—), 男, 河北省保定人, 硕士, 研究员, 1986年、1992年于河北大学分别获得分析化学专业学士学位、硕士学位, 主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn

  • 中图分类号: O657.3

Spectral analysis and theoretical modeling of the working mechanism of meloxicam and lysozyme

Funds: 

National Natural Science Foundation of China 21375032

More Information
  • 摘要: 为了探究美洛昔康与溶菌酶的作用机制,在pH=7.40的实验条件下,采用荧光光谱、同步荧光光谱和理论模建分析技术研究了类风湿性关节炎药物美洛昔康与溶菌酶分子之间的相互作用。结果表明,美洛昔康能够以静态猝灭形式有效地猝灭溶菌酶的内源荧光,形成1:1的复合物,并使溶菌酶的构象发生改变。热力学结果表明,美洛昔康-溶菌酶体系的主要作用力类型为疏水作用力。理论模建结果表明,该体系除疏水作用外还存在氢键作用,且美洛昔康被溶菌酶的活性氨基酸残基Glu35和Asp52包围,结合作用改变了溶菌酶催化活性中心处氨基酸残基的微环境。当患者服用15 mg美洛昔康时,美洛昔康与溶菌酶的蛋白结合率WB)为3.71%~8.79%,说明美洛昔康与溶菌酶的结合对溶菌酶自身抗炎、抗菌功能的影响不大,体系药物结合率WQ)为1.08%~1.14%,说明溶菌酶与美洛昔康结合不会影响美洛昔康的药效。该研究从理论上证明了溶菌酶在血浆环境中与药物美洛昔康结合后,对溶菌酶本身功能和美洛昔康的药效不会产生严重影响。
  • 图  1  MEL-LYSO的荧光发射光谱(T=310 K, λex=280 nm)

    Figure  1.  Fluorescence emission spectra of MEL-LYSO system (T=310 K, λex=280 nm).CLYSO=5.0×10-7 mol/L, 1~9 CMEL=(0, 0.05, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

    图  2  MEL与LYSO作用的相对荧光曲线(T=310 K)

    Figure  2.  Relative fluorescence curves of the interaction between MEL and LYSO(T=310 K). Concentration of LYSO CLYSO=5.0×10-7 mol/L, Concentration of MEL CMEL=(0.05, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

    图  3  MEL-LYSO体系的荧光强度随NaCl浓度的变化(T=310 K)

    Figure  3.  Fluorescence intensity of MEL-LYSO system as a function of NaCl concentration (T=298 K). CLYSO=5.0×10-7 mol/L, CMEL=1.0×10-5 mol/L, CNacl =(0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0) ×10-1mol/L

    图  4  MEL-LYSO体系的同步荧光光谱(T=310 K) (a) Δλ=60 nm; (b) Δλ=15 nm

    Figure  4.  Synchronous fluorescence spectra of MEL-LYSO system (T=310 K). (a) Δλ=60 nm; (b) Δλ=15 nm.CLYSO=5.0×10-7 mol/L, 1~9 CMEL=(0, 0.05, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

    图  5  MEL与LYSO相互作用的理论模建图。(a) MEL与LYSO发生作用区域及MEL与LYSO的氨基酸残基之间的氢键; (b) MEL与LYSO结合部位的氨基酸残基分布情况

    Figure  5.  Theoretical modeling of the interaction between MEL and LYSO. (a) Regions where MEL interacts with LYSO and hydrogen bonds between docked MEL and amino acids residues of LYSO; (b) Distribution of amino and residues at the bonding site of MEL and LYSO

    表  1  不同温度下MEL-LYSO体系的猝灭反应参数

    Table  1.   Quenching reactive parameters of MEL-LYSO at different temperatures

    λex/(nm) T/(K) Kq/(L·mol-1·s-1) Ksv/(L·mol-1) r1 Ka/(L·mol-1) n r2
    280 293 2.08×1012 2.08×104 0.993 2 2.34×104 1.08 0.992 2
    308 1.59×1012 1.59×104 0.993 9 1.71×104 1.06 0.996 9
    318 1.28×1012 1.28×104 0.995 7 1.31×104 1.22 0.995 6
    295 293 1.53×1012 1.53×104 0.993 8 1.62×104 1.17 0.994 2
    308 1.18×1012 1.18×104 0.996 5 1.23×104 1.12 0.996 9
    318 0.89×1012 0.89×104 0.997 4 0.93×104 1.03 0.991 5
    注:r1为方程F0 /F~[L]的线性相关系数; r2为方程lg[(F0-F)/F]~lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的线性相关系数;[Bt]=5.0×10-7 mol/L
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    表  2  不同温度下MEL-LYSO体系的热力学参数(λex=280 nm)

    Table  2.   The thermodynamic parameters of MEL-LYSO at different temperatures(λex=280 nm)

    T/K Ka/L·mol-1 ΔH/kJ·mol-1 ΔS/J·mol-1·K-1 ΔG/kJ·mol-1
    298 2.34×104 7.82 -24.93
    310 1.71×104 -22.59 8.15 -25.12
    318 1.31×104 7.76 -25.06
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    表  3  MEL-LYSO体系的对接能量(单位:kJ/mol)

    Table  3.   Docking energy of MEL-LYSO system (unit: kJ/mol)

    Protein PDB ID ΔG0 ΔE1 ΔE2 ΔE3
    2LYZ -27.81 -31.53 -31.11 -0.42
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-29
  • 修回日期:  2019-04-30
  • 刊出日期:  2020-04-01

美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究

doi: 10.3788/CO.20201302.0354
    基金项目:

    国家自然科学基金资助项目 21375032

    作者简介:

    程旭(1993—), 男, 山东潍坊人, 硕士研究生, 2017年于济宁学院获得学士学位, 主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:2547034720@qq.com

    刘保生(1963—), 男, 河北省保定人, 硕士, 研究员, 1986年、1992年于河北大学分别获得分析化学专业学士学位、硕士学位, 主要从事分子发光学理论与应用研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn

  • 中图分类号: O657.3

摘要: 为了探究美洛昔康与溶菌酶的作用机制,在pH=7.40的实验条件下,采用荧光光谱、同步荧光光谱和理论模建分析技术研究了类风湿性关节炎药物美洛昔康与溶菌酶分子之间的相互作用。结果表明,美洛昔康能够以静态猝灭形式有效地猝灭溶菌酶的内源荧光,形成1:1的复合物,并使溶菌酶的构象发生改变。热力学结果表明,美洛昔康-溶菌酶体系的主要作用力类型为疏水作用力。理论模建结果表明,该体系除疏水作用外还存在氢键作用,且美洛昔康被溶菌酶的活性氨基酸残基Glu35和Asp52包围,结合作用改变了溶菌酶催化活性中心处氨基酸残基的微环境。当患者服用15 mg美洛昔康时,美洛昔康与溶菌酶的蛋白结合率WB)为3.71%~8.79%,说明美洛昔康与溶菌酶的结合对溶菌酶自身抗炎、抗菌功能的影响不大,体系药物结合率WQ)为1.08%~1.14%,说明溶菌酶与美洛昔康结合不会影响美洛昔康的药效。该研究从理论上证明了溶菌酶在血浆环境中与药物美洛昔康结合后,对溶菌酶本身功能和美洛昔康的药效不会产生严重影响。

English Abstract

程旭, 刘保生, 张红彩. 美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究[J]. 中国光学, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
引用本文: 程旭, 刘保生, 张红彩. 美洛昔康与溶菌酶作用机制的光谱分析及理论模建研究[J]. 中国光学, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
CHENG Xu, LIU Bao-sheng, ZHANG Hong-cai. Spectral analysis and theoretical modeling of the working mechanism of meloxicam and lysozyme[J]. Chinese Optics, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
Citation: CHENG Xu, LIU Bao-sheng, ZHANG Hong-cai. Spectral analysis and theoretical modeling of the working mechanism of meloxicam and lysozyme[J]. Chinese Optics, 2020, 13(2): 354-362. doi: 10.3788/CO.20201302.0354
    • 非甾体抗炎药可以减轻疼痛和水肿, 从而起到治疗炎症的作用, 然而患者服用非甾体抗炎药后往往会引起胃炎, 胃溃疡, 肾脏和肝脏损伤等不良症状[1]。美洛昔康(meloxicam, 简称MEL)是一种非甾体抗炎药[2], 它是常见的治疗类风湿性关节炎的药物, 具有良好缓解身体疼痛的功效[3], 与其他的非甾体抗炎药(如扶他林, 布洛芬等)相比毒副作用较小。

      溶菌酶(lysozyme, 简称LYSO)相对分子质量约为14 600[4], 是一种广泛存在于动物体内的碱性蛋白,除了具有非常重要的抗菌活性外, 还具有治疗炎症, 调节机体免疫能力, 抗组胺以及抑制肿瘤活性等生物功能。因此LYSO常作为一种重要的蛋白模型被加以研究。

      近年来, 荧光光谱已经成为研究配体-蛋白质体系作用机制的重要手段, 具有良好的灵敏度和选择性[5],在生物分析和药物分析领域有广泛应用[6]。到目前为止,王金菊[7]通过荧光光谱法, 研究了特效的支原体病治疗药物——酒石酸泰乐菌素与LYSO的相互作用; 颜娟[8]通过荧光光谱法, 研究了心血管疾病类治疗药物牡荆苷与LYSO的作用机制; 陈晨[9]通过荧光光谱法, 研究了抗癌类药物奥沙利铂与LYSO的结合作用; 方庆[10]通过光谱法和分子对接法, 解释了抗菌消炎类药物氟罗沙星与LYSO的结合机制。但是大多数已有研究只是停留在配体与LYSO的结合机理方面,通过光谱法研究LYSO作为运载蛋白与药物分子的结合作用, 进而推断其对药物的药效及LYSO活性影响的研究相对较少。本文通过荧光实验及理论模建等方法获得了一系列实验数据,从而揭示了MEL-LYSO的结合机理并通过体系的结合率预测了MEL在人体内与LYSO结合后对药物的药效和酶的性质的影响, 对快速预测药物和人体内的蛋白质间的相互作用产生的影响提供了有益参考。

    • 仪器:RF-5301PC荧光仪(日本岛津); SYC-15B型超级恒温水浴(南京桑力电子设备厂); SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

      试剂:LYSO(纯度不低于99%, Sigma公司), 储备液(5.0×10-6 mol/L); MEL(CAS#, 71125-28-7), 储备液(4.0×10-4 mol/L); 配制pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液(内含0.15 mol/L NaCl, 维持生理条件下的离子强度)。实验用水均为二次石英蒸馏水, 以上储备液均在277 K下避光保存。

    • 荧光光谱测定:在298 K、310 K、318 K温度下, 在10.0 mL比色管中加入1.0 mL Tris-HCl缓冲溶液, 1.0 mL LYSO(5.0×10-6 mol/L)溶液和不同体积的MEL溶液, 定容, 恒温30 min。狭缝宽为5 nm, λex分别为280、295 nm, 扫描荧光光谱。Δλ为15 nm或60 nm, 扫描同步荧光光谱。

      分子对接:LYSO的晶体结构(PDB ID: 2LYZ)来自蛋白数据库(Protein Data Bank)。利用ChemDraw Pro 14.0和ChemBio 3D Ultra 14.0绘制MEL结构式, 对其三维结构进行能量最小化处理。用AutoDock 4.2.6对MEL和LYSO进行模建研究, 采用遗传算法来计算MEL与LYSO结合的可能构象[11]

    • λex=280 nm时MEL与LYSO作用的荧光光谱图(λex=295 nm时, MEL-LYSO的荧光光谱图与其类似, 但荧光强度较低)如图 1所示。结果表明LYSO在343 nm处的荧光峰随MEL浓度的增加依次猝灭且发射峰发生蓝移, 说明MEL-LYSO体系发生相互作用并生成了稳定的复合物[12]

      图  1  MEL-LYSO的荧光发射光谱(T=310 K, λex=280 nm)

      Figure 1.  Fluorescence emission spectra of MEL-LYSO system (T=310 K, λex=280 nm).CLYSO=5.0×10-7 mol/L, 1~9 CMEL=(0, 0.05, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

      式(1)是Stern-Volmer[13]方程, 通过式(1)可以利用实验所得到的荧光信号数据计算出猝灭常数Ksv以及猝灭速率常数Kq

      (1)

      其中,F0F为无/有猝灭剂时的荧光强度; τ0和[L]分别为分子荧光平均寿命(约为10-8 s)和猝灭剂浓度, 计算结果见表 1表 1表明不同温度下的Kq值均大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2×1010 L/mol·s[14], 同时从表 1中的数据还可以看出,随着温度的升高, MEL-LYSO体系的Kq以及Ksv的值均降低, 这一结果则说明MEL-LYSO体系的猝灭方式为静态猝灭。

      表 1  不同温度下MEL-LYSO体系的猝灭反应参数

      Table 1.  Quenching reactive parameters of MEL-LYSO at different temperatures

      λex/(nm) T/(K) Kq/(L·mol-1·s-1) Ksv/(L·mol-1) r1 Ka/(L·mol-1) n r2
      280 293 2.08×1012 2.08×104 0.993 2 2.34×104 1.08 0.992 2
      308 1.59×1012 1.59×104 0.993 9 1.71×104 1.06 0.996 9
      318 1.28×1012 1.28×104 0.995 7 1.31×104 1.22 0.995 6
      295 293 1.53×1012 1.53×104 0.993 8 1.62×104 1.17 0.994 2
      308 1.18×1012 1.18×104 0.996 5 1.23×104 1.12 0.996 9
      318 0.89×1012 0.89×104 0.997 4 0.93×104 1.03 0.991 5
      注:r1为方程F0 /F~[L]的线性相关系数; r2为方程lg[(F0-F)/F]~lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的线性相关系数;[Bt]=5.0×10-7 mol/L

      对于静态猝灭, 一般用公式(2)[15]来计算该体系的结合常数Ka和结合位点数n:

      (2)

      其中,[Bt]代表LYSO的浓度, 计算结果见表 1。由表 1可得, 实验温度下n≈1, 说明MEL在与LYSO结合时只存在一个高亲和力的结合位点[16], 即MEL与LYSO形成了1 :1的复合物。温度升高, 结合常数Ka值都在104数量级,并且呈现降低趋势。MEL与LYSO的结合能力随温度升高而减小, 进一步证明了MEL-LYSO体系的荧光猝灭是静态猝灭。图 2为MEL-LYSO体系中LYSO的Tyr和Trp残基参与反应情况。图 2显示, 当λex = 280 nm和λex =295 nm的时候, MEL-LYSO体系的猝灭曲线是分离开的, 并没有重合到一起, 这说明LYSO中的Trp残基与Tyr残基都参加了反应; 而λex=295 nm时MEL-LYSO体系的猝灭曲线的斜率明显比λex=280 nm时结合体系的猝灭曲线斜率要小, 这个结果则说明在λex=280 nm时LYSO荧光猝灭程度更强。

      图  2  MEL与LYSO作用的相对荧光曲线(T=310 K)

      Figure 2.  Relative fluorescence curves of the interaction between MEL and LYSO(T=310 K). Concentration of LYSO CLYSO=5.0×10-7 mol/L, Concentration of MEL CMEL=(0.05, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

    • 根据van′t Hoff方程[17]计算MEL-LYSO之间相互作用的热力学参数, 计算结果见表 2

      表 2  不同温度下MEL-LYSO体系的热力学参数(λex=280 nm)

      Table 2.  The thermodynamic parameters of MEL-LYSO at different temperatures(λex=280 nm)

      T/K Ka/L·mol-1 ΔH/kJ·mol-1 ΔS/J·mol-1·K-1 ΔG/kJ·mol-1
      298 2.34×104 7.82 -24.93
      310 1.71×104 -22.59 8.15 -25.12
      318 1.31×104 7.76 -25.06
      (3)
      (4)

      其中R是气体常数(值约为8.314), 表征MEL和LYSO之间结合作用的ΔH和ΔS都可以通过结合常数的自然对数(lnKa)和温度的倒数(1/T)之间的线性关系来计算, 所得结果列于表 2。由表 2可知, ΔG < 0, 表明MEL与LYSO的结合反应是自发进行的, ΔH < 0,表明MEL-LYSO复合物的形成是放热反应。由于水分子的排列以更加有序的方式围绕药物和蛋白质建立更加随机的配置,因此ΔS>0, 通常作为药物分子和蛋白分子之间存在疏水作用力的证据[18], 基于这一点可以判断MEL与LYSO之间存在疏水作用力。

      Ross和Subramanian[19]认为当ΔH≈0, ΔS>0时, 药物分子与生物大分子之间存在静电引力, 但是现在部分报道认为当ΔH < 0, ΔS>0可以直接判断结合体系之间主要作用力类型是静电作用[20]。为了进一步验证MEL与LYSO之间的主要作用力是否是静电作用力, 本文探讨了离子强度对MEL-LYSO相互作用的影响。

      固定MEL和LYSO的浓度, 分别加入不同浓度的NaCl, 以F/F0CNaCl作图, 其中F为加入NaCl的荧光强度,F0为未加入NaCl时的荧光强度,结果见图 3

      图  3  MEL-LYSO体系的荧光强度随NaCl浓度的变化(T=310 K)

      Figure 3.  Fluorescence intensity of MEL-LYSO system as a function of NaCl concentration (T=298 K). CLYSO=5.0×10-7 mol/L, CMEL=1.0×10-5 mol/L, CNacl =(0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0) ×10-1mol/L

      实验结果表明, 当NaCl浓度升高时, F/F0的比值并未发生明显变化, 说明MEL与LYSO的结合并不受离子强度的影响, 即MEL-LYSO体系并没有明显的静电相互作用。如果静电相互作用在蛋白质与配体的结合中起主导作用, 那么随着体系中盐浓度的增加, 蛋白质和配体之间的相互作用强度则会逐渐降低[21]。这也说明当ΔH < 0, ΔS>0时,无法直接判断MEL-LYSO体系之间的主要作用力是静电作用力。

    • 同步荧光法具有较高的灵敏度和选择性,在药物与蛋白质相互作用的研究中应用越来越广泛[22]。通过测量结合体系同步荧光光谱的最大发射波长的位移情况, 可以探索荧光发光团附近的氨基酸残基的环境信息[23]。如图 4所示, 当Δλ=60 nm和Δλ=15 nm的时候, LYSO的荧光信号的强度均呈现降低的趋势, 而且Trp残基和Tyr残基的荧光峰都发生了极其微弱的移动,这意味着MEL与LYSO的结合作用使得LYSO这种小分子蛋白质中的氨基酸残基的微环境发生了改变, 使它的疏水性减小, 肽链伸展程度增加[24],且Tyr和Trp残基共同参与了结合反应,这与3.1结论一致。

      图  4  MEL-LYSO体系的同步荧光光谱(T=310 K) (a) Δλ=60 nm; (b) Δλ=15 nm

      Figure 4.  Synchronous fluorescence spectra of MEL-LYSO system (T=310 K). (a) Δλ=60 nm; (b) Δλ=15 nm.CLYSO=5.0×10-7 mol/L, 1~9 CMEL=(0, 0.05, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0)×10-5 mol/L

    • 理论模建的研究方法在探究配体和受体的相互作用中发挥着极其重要的作用, 为了进一步确定MEL-LYSO体系的结合位置以及MEL与LYSO结合之后对于配体和受体的影响, 文章利用理论模建的方法建立了MEL与LYSO的结合模型。通过该方法建立体系的模型可以获得MEL与LYSO结合体系的作用力类型和最低结合能。图 5(a)(彩图见期刊电子版)给出了MEL与LYSO结合之后的最佳结合位置, Asp52残基、Ser50残基分别与MEL形成了两个氢键, 键长分别为2.104Å和2.241Å。这个结果说明了氢键在MEL与LYSO的结合过程中发挥了重要的作用。图 5(b)(彩图见期刊电子版)显示了MEL周围有Ala95,Tyr53,Trp62,Trp63,Trp108,Ieu56,Ile58和Ile98等多个疏水性氨基酸残基, 进一步说明在MEL和LYSO的结合过程中存在疏水作用力, 其中Tyr53, Trp62, Trp63和Trp108等氨基酸残基距离MEL和LYSO的结合位置相对较近, 进而导致MEL与LYSO的结合作用能够有效猝灭LYSO的内源荧光, 这个结果与荧光猝灭实验的结论一致。Glu35残基和Asp52残基是LYSO的活性氨基酸残基[25], 从图 5(b)还可以看出MEL结合位置在Glu35残基和Asp52残基附近。理论模建的结果说明MEL与LYSO的结合能够改变LYSO催化活性中心处氨基酸残基的微环境, 也就是说MEL与LYSO的结合可能会对LYSO的催化活性产生影响。

      图  5  MEL与LYSO相互作用的理论模建图。(a) MEL与LYSO发生作用区域及MEL与LYSO的氨基酸残基之间的氢键; (b) MEL与LYSO结合部位的氨基酸残基分布情况

      Figure 5.  Theoretical modeling of the interaction between MEL and LYSO. (a) Regions where MEL interacts with LYSO and hydrogen bonds between docked MEL and amino acids residues of LYSO; (b) Distribution of amino and residues at the bonding site of MEL and LYSO

      根据理论模建所获得的能量数据可知, MEL-LYSO复合物的最低结合能为ΔG0=-27.81 kJ/mol, 与实验得到的ΔG=-25.12 kJ/mol比较接近。数据结果的差异可能是由于在对接模拟中排除了溶剂或除氨基酸残基Trp, Tyr之外的受体的刚性[26]。MEL与LYSO体系的理论模建的具体能量数据见表 3。从表中数据可以看出,MEL-LYSO体系的静电力远低于MEL与LYSO结合过程中的范德华能量, 氢键能量和去溶剂化自由能之和, 即MEL与LYSO之间的静电作用非常微弱。这个结果与离子强度对于MEL-LYSO体系荧光信号影响的实验结果一致。结合荧光实验数据和理论模建结果可知,疏水作用和氢键是驱动MEL分子与LYSO分子相结合从而导致LYSO发生静态猝灭的主要作用力。

      表 3  MEL-LYSO体系的对接能量(单位:kJ/mol)

      Table 3.  Docking energy of MEL-LYSO system (unit: kJ/mol)

      Protein PDB ID ΔG0 ΔE1 ΔE2 ΔE3
      2LYZ -27.81 -31.53 -31.11 -0.42

      表 3中,ΔG0是MEL-LYSO的结合自由能。ΔE1是分子间相互作用能, 它是范德华能, 氢键能, 去溶剂化自由能和静电能的总和。ΔE2是范德华能, 氢键能和去溶剂化自由能的总和。ΔE3是静电能。

    • 研究药物-蛋白质体系的蛋白结合率和药物结合率有助于进一步研究药物分子和蛋白分子的相互作用情况, 从而可以对药物分子在人体内与某些蛋白质发生结合作用后, 对于药物的药效, 蛋白质本身的性质和作用以及对人体生理功能等所产生的影响可以做出一个简单的预测。根据荧光实验所得Ka可以计算得到MEL与LYSO的药物结合率和蛋白结合率。当n=1时, MEL-LYSO体系的结合率(W)如公式(5)、(6)所示[27], 其中, Q代表MEL的总浓度, B代表LYSO的总浓度。

      药物结合率:

      (5)

      蛋白结合率:

      (6)

      当患者服用MEL时, 药物分子通过人体的消化系统被快速吸收进入血液循环, 这时MEL便不可避免地会与血浆中的LYSO接触并发生作用。当患者服用MEL为15 mg时, 血浆中MEL的浓度范围约为0.8~2.0 μg/ml[28],LYSO在血浆中的浓度约是10.27 μg/ml[29]。利用λex=280 nm时实验所得的Ka值,并结合式(5)、式(6)可以得到:3.71%≤W(B)≤8.79%, 即患者服用15 mg的MEL后, 患者血浆中游离的LYSO含量约为91.21%~96.29% (LYSO在体内的结合作用是一个很复杂的过程, 该研究不考虑LYSO与血浆中其它物质的结合)。这个结果则表明,患者口服MEL后, 对于游离LYSO的含量影响不大, 这也意味着MEL口服进入人体后, 对于LYSO的抗炎杀菌能力的影响并不大。同时根据式(5)、式(6)可以得到:1.08%≤W(Q)≤1.14%, 这个结果则说明MEL口服进入人体后,LYSO与MEL的结合对于MEL药效的影响可以忽略不计。

    • 本文在模拟生理条件下, 采用荧光分析和理论模建的方法研究了MEL与LYSO之间的相互作用, 建立了MEL与LYSO的结合率模型, 利用结合率模型对MEL和LYSO的相互作用对药物的药效和LYSO本身抗炎杀菌功能提出了简单的预测, 为研究蛋白质分子和药物小分子间相互作用对蛋白质性质和药物药效的影响提供了一条新的思路。通过荧光分析法研究配体-蛋白质体系的结合率, 与其它常用的平衡透析法等方法相比, 在结合常数、结合位点数等数值上会存在一定误差, 但这些常用的结合率研究方法的实验设备昂贵、实验周期长且实验药物浓度范围较窄, 而利用光谱法研究结合率的方法操作简单、快速, 适用范围广。

参考文献 (29)

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